Кайо к1 характеристики: KAYO K1: цена Кайо K1, технические характеристики Кайо K1, фото, видео, отзывы

Содержание

KAYO K1: цена Кайо K1, технические характеристики Кайо K1, фото, видео, отзывы

Технические характеристики KAYO K1

Цена

103 990 — 115 000

Мин. цена

103 990

Макс. цена

115 000

Модельный год 2019
Тип Мотоцикл
Класс Мотоцикл эндуро
Длина, мм 2010
Ширина, мм 840
Высота, мм 1160
Высота по седлу, мм 875
Страна сборки Китай

Модификации KAYO K1

KAYO K1 250 MX

Цена от

103 990

Максимальная скорость, км/ч
Время разгона до 100 км/ч, сек
Двигатель Бензиновый карбюраторный
Число цилиндров / расположение 1
Количество тактов 4
Рабочий объем, см3 233
Мощность, л. с. / оборотах 16.4
Момент, н·м / оборотах
Расход топлива, л на 100 км
Снаряженная масса, кг 105
Тип коробки передач Механическая
Система охлаждения Воздушная
Показать все характеристики

KAYO K1 250 Enduro

Максимальная скорость, км/ч
Время разгона до 100 км/ч, сек
Двигатель Бензиновый карбюраторный
Число цилиндров / расположение 1
Количество тактов 4
Рабочий объем, см3 233
Мощность, л.с. / оборотах 16. 4/7000
Момент, н·м / оборотах 17.5/5500
Расход топлива, л на 100 км
Снаряженная масса, кг 105
Тип коробки передач Механическая
Система охлаждения Воздушная
Показать все характеристики

Одноклассники KAYO K1 по цене

От 117 990

До 135 000

Мотоцикл эндуро

Китай

Год: 2019

От 95 000

До 105 000

Мотоцикл эндуро

Беларусь

Год: 2019

Отзывы владельцев KAYO K1

KAYO K1, 2017 г

Итак. Наши мотоциклы уже достаточно проехали, что можно сделать первое впечатление. Самое интересное, что попалось на ремонт — это крепление слайдера цепи на маятнике. Отломилось по сварке. Ухо подрамника крепления выхлопной банки. Тоже отломилось и пришлось переваривать данную конструкцию. Светотехника на KAYO K1 подвержена жесткой эксплуатации и ничем не защищена. Требует герметика и соединения и сами фары. Задняя на эндуро версии вообще постоянно плавает в грязи и лужах. Ведомая звезда может не ровно встать в посадочном седле на ступице колеса. Будет проблема с натяжкой цепи. Пластик имеет хорошую живучесть, но после переборки начинает вылезать со своих пазов (появляются щели). Особенно подвержена правая боковина. Обода — алюминий, но вот восьмерки пришлось устранять подтяжкой спиц. Карбюратор исправно работает, но тоже может дать сбой. Была оказия, когда во время движения выпал малый жиклер в ванну. Обратить внимание и при первой возможности снять его и протянуть жиклеры. Крышка картера не дает настроить лапку переключения передач на горизонтальное положение. Тормозная лапка требует отгиба иначе очень неудобно ее нажимать.

   Достоинства: резвый. Управляемость, как у велосипеда. Цена.

   Недостатки: в отзыве.

  Сергей, Новотроицк


KAYO K1, 2018 г

Всем привет. Напишу, с чем столкнулся сразу после покупки KAYO K1. Сиденье жесткое очень, некомфортно, натирает. «Нейтраль» поймать сложно, так и не приноровился сразу ловить ее. Не болячка, а просто доработка, лучше приделать петлю «помогайку» на заднее сиденье, в трудных участках доставать. Лапка заднего тормоза сильно приближена под корпус двигателя — лечится простым отгибанием вбок. Защита перьев руля чиркает об перо вилки при работе со стороны тормоза, пока не придумал, как решить, вероятно, может перетереть сальник пера. Подсос карбюратора запрятан в какие-то дебри, неудобно, да и регулировать холостой ход в перчатках не очень удобно. Руль сильно низкий для моего роста (190), но это не проблема, а особенность. Передний тормоз, на мой взгляд, слабоват. При выявлении еще каких-либо особенностей постараюсь написать. В целом мотоцикл очень нравится.

   Достоинства: быстрый. Недорогой. Приемистый двигатель.

   Недостатки: жесткое седло. Сложно поймать «нейтраль».

  Петр, Орджоникидзе

 

Обои рабочего стола KAYO K1

 

 

1024×768

 

1280×1024

Обои KAYO K1

 

KAYO K1 — краткий обзор

KAYO K1 250 / Кайо K1 250

Новый кросс-эндуро KAYO K1 отличается простой конструкцией и имеет достойные ходовые характеристики для преодоления любых трасс. Байк облачен в узкий корпус, окрашенный в фирменные тона марки. Небольшая колесная база, высокий клиренс и удобная эргономика посадки обеспечивают высокую проходимость и достаточную уверенность передвижения. Благодаря полному комплекту светотехники на KAYO K1 разрешено передвигаться по дорогам общего назначения.

250-кубовый силовой агрегат с мощностью 16.4 hp обеспечивает достаточный для быстрой езды запас тяги. Запуск двигателя осуществляется с помощью электростартера, в случае разряда АКБ мотоцикл можно завести с помощью надежного кикстартера. Карбюраторная система питания JK26 настроена на повышение производительности в любом рабочем диапазоне, она не требовательна и проста в настройке. Облегченный глушитель KAYO K1 порадует приятным, благородным звучанием.

Используемая в передней подвеске телескoпическая вилка 800 мм, а также задний маятник повышают управляемость KAYO K1 и улучшают ходовые качества на дорогах с отсутствующим ровным покрытием. В базовом исполнении мотоцикл оборудован легкими алюминиевыми дисками колес с грязевой резиной, мощной 520-й цепью, аккумуляторной батареей на 6 Ah. Тормозная система KAYO K1 представлена дисковыми механизмами с отличной обратной связью.

Мотоцикл кроссовый KAYO K1 250 Enduro (2016),

Технические характеристики

Тип двигателя ДВС
Двигатель

4-тактный

Запуск двигателя

электростартер + кикстартер

Зажигание

Электронное CDI

Рабочий объем 223 см³
Мощность двигателя 16.4 л.с.
Число цилиндров

1

Трансмиссия
Число передач

5

Объем топливного бака
Топливная система
Подача топлива

карбюратор

6.7 л
Эксплуатационные показатели
Топливо

АИ-92

Габариты и Масса
Вес

85 кг.

Габариты (Д х Ш х В)

2 010 x 840 x 1 160, мм

Высота посадки
Параметры
875 мм
Колесная база 1340 мм
Тормозная система
Передний тормоз

Диск

Задний тормоз

Диск

Передняя шина
Колёса

R21

Задняя шина

R18

Основные характеристики
Год выпуска 2016 г.
Модельный год

2016 —
по настоящее время

★ Кайо — 1874 год в политике .

. Информация

Пользователи также искали:



кайо 125,

кайо 140,

кайо к1 характеристики,

кайо к2,

кайо т2,

купить мотоцикл кайо т2,

кайо,

Кайо,

кайо т,

мотоцикл,

купить,

характеристики,

купить мотоцикл кайо т,

кайо к,

кайо к характеристики,

кайо т2,

купить мотоцикл кайо т2,

кайо к2,

кайо к6,

кайо к1 характеристики,

кайо 140,

кайо 125,

кайо к1,

1874 год в политике. кайо,

1874 год в политике

Пользователи также искали:



лонг (значения),

long,

данных,

типы,

long int,

типы данных,

Лонг,

char,

значение,

максимальное,

java,

long максимальное значение,

тип данных char,

типы данных c,

long int c,

long c,

значения,

Лонг значения,

тип long java,

кайо,

Кайо,

кайо т,

мотоцикл,

купить,

характеристики,

купить мотоцикл кайо т,

кайо к,

кайо к характеристики,

фрей (значения),

Фрей,

Базовые настройки подвески мотоцикла | Моск

Перед началом эксплуатации мотоцикла рекомендуется проверить базовые настройки подвески. Заводская настройка всегда рассчитана на Райдера среднего веса и роста.

Неправильные настройки, например преднатяга (Pre-load) пружины или неверно выбранная жесткость пружины, может изменить углы подвески, что вызовет или избыточную или недостаточную поворачиваемость и тем самым будет очень сильно повлиять на управляемость мотоцикла. После настройки подвески под индивидуальные требования райдера также необходима проверка и коррекция базовой настройки подвески.

ШАГ 1. ИЗМЕРЕНИЕ.

ВАЖНО!

Преднатяг пружин передней и задней подвески. Очень важная установка влияющая на высоту мотоцикла и угол вилки. Что в свою очередь влияет на управляемость мотоцикла. Все операции проще выполнять вдвоем. Все замеры записывайте.

 

Мотоцикл на центральной подставке

Мотоцикл на колесах

Мотоцикл с водителем

1.Установите мотоцикл на подставку, что бы колеса мотоцикла не касались земли.

2.Измерьте расстояние, например от нижней точки заднего крыла до оси заднего колеса. (R1)

3.Сделайте такое же измерение для передней подвески. В качестве контрольных точек можно выбрать верхнюю траверсу и ось переднего колеса. (F1) 

4.Снимите мотоцикл с центральной подставки и произведите те же измерения без райдера (R2 и F2)

5. Повторите измерения в третий раз с райдером. (R3 F3). 

ВАЖНО!

Райдер обязательно должен принять правильную посадку, что бы правильно распределить нагрузку по осям мотоцикла.

РЕКОМЕНДОВАННЫЕ ЗНАЧЕНИЯ СВОБОДНОГО ПРОГИБА (FREE SAG) И ПРОГИБ ПОД РАЙДЕРОМ

МОТОЦИКЛ / ОСЬ                     СВОБОДНЫЙ ПРОГИБ (FREE SAG) R1-R2 И F1-F2                ПРОГИБ ПО РАЙДЕРОМ R1-R3 И F1-F3

MX/ENDURO ПЕРЕДНЯЯ                                            30 + — 5 ММ                                                           80 + — 5 ММ                                                         

MX/ENDURO ЗАДНЯЯ                                                30 + — 5 ММ                                    100 + — 5 ММ  ИЛИ 30% ОТ ПОЛНОГО   ХОДА                      

ДОРОЖНЫЙ ПЕРЕДНЯЯ                                              20-30 ММ                                                               30-40 ММ                                                        

ДОРОЖНЫЙ ЗАДНЯЯ                                                    5-15 ММ                                                               25-35 ММ 

ТУРИСТИЧЕСКИЙ ENDURO ПЕРЕДНЯЯ                     20-30 ММ                                                               30-40 ММ                                                        

ТУРИСТИЧЕСКИЙ ENDURO ЗАДНЯЯ                            5-15 ММ                                                               25-35 ММ 

ВАЖНО!

Если значения отличаются в большую сторону (клиренс меньше) то установленна мягкая пружина или недостаточный преднатяг ее, если в меньшую (клиренс больше), то пружина жесткая или большой преднатяг.

ШАГ 2. РЕГУЛИРОВКА

Регулировка предварительного сжатия пружины амортизаторов выполняется либо специальным  инструментом, либо рукояткой, в зависимости от исполнения вашего амортизатора. Для амортизаторов с классическим механизмом регулировки, необходимо отпустить ключом верхнюю специальную гайку, далее выполнить регулировку нижней гайкой и в заключении обязательно затянуть верхнюю гайку. Рис. 1.

РЕГУЛИРОВКА ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО СЖАТИЯ ПРУЖИНЫ АМОРТИЗАТОРА

РЕГУЛИРОВКА ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО СЖАТИЯ ПРУЖИНЫ ПЕРЕДНЕЙ ВИЛКИ

Передняя вилка, конструктивно, может быть выполнена как с возможностью регулировки преднатяга так и без нее. В случае отсутствия такой возможности потребуется замена пружины на более мягкую\жесткую в зависимости от результатов измерения.

НАСТРОЙКА ХАРАКТЕРИСТИК АМОРТИЗАТОРА

РЕГУЛИРОВКА ОБЩЕЙ ДЛИНЫ АМОРТИЗАТОРА

Если амортизатор имеет возможность регулировки длинны, то изменяя только этот параметр вы можете изменять чувствительность рулевого управления не затрагивая других характеристик.

ВАЖНО!

Никогда не закручивайте и не выкручивайте полностью регулировочный болт на амортизаторе.

ВАЖНО!

Правильная настройка амортизатора непосредственно влияет на безопасность и управляемость мотоцикла. Придерживаясь следующих рекомендаций вы можете вносить изменения методом контрольных заездов. Изменив значение на один два «клика»  — пробная поездка. И так далее.

НАСТРОЙКА ДЕМПФИРОВАНИЯ ОТБОЯ (REBOUND)

+  Увеличение усилия демпфирования

—  Уменьшение усилия демпфирования

Характеристика влияет на скорость с которой амортизатор возвращается в исходное положение после цикла сжатия. Слишком слабое усилие вызывает раскачку мотоцикла, сильно жёсткое не позволяет подвески быстро вернуться в исходное положение на мелких неровностях, что в свою очередь приводит к полному сжатию подвески.

Регулятор расположен в нижней части штока. Позиции определяются с характерным «кликом».

ВАЖНО!

Если вы не чувствуете «кликов», то это может свидетельствовать о неисправности амортизатора. Например низком давлении газа или низким уровнем масла.

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ!

Если мотоцикл раскачивает на неровностях или чувствуется удар при возвращении подвески в исходное положение, увеличьте усилие отбоя. Если чувствуется повышенная жесткость, а на серии неровностей жёсткость увеличивается, то усилие отбоя слишком велико- его нужно уменьшить. Регулировку выполняете в диапазоне не более 2-х кликов за один раз.

НАСТРОЙКА ДЕМПФИРОВАНИЯ СЖАТИЯ (COMPRESION)

Регулировка расположена в верхней части амортизатора.

В зависимости от модели амортизатора регулировка быстрой

и медленной скорости сжатия может быть разнесена

Регулировка низкой скорости сжатия выполняется отверткой и имеет 25 «кликов»

 

Регулировка высокой скорости сжатия выполняется ключом (чаще 17 мм) в диапазоне 2 ¼ оборота. При регулировке вращайте за одну тестовою поездку не более ½ оборота. (180 град)

ВАЖНО!

Что бы правильно считать клики, полностью закрутите регулировочный узел и открутите на заданную величину.

ВАЖНО!

Выражение высокая и низкая скорость относится к скорости движения штока амортизатора, а не к скорости движения мотоцикла!

ВАЖНО!

Все настройки начинайте с параметров рекомендованных заводом изготовителем. Всегда записывайте внесенные изменения и свои ощущения от пробной поездки. За один цикл делайте не более 6 «кликов» и ½ оборота регулировочного узла. За один раз настраивайте только один параметр.

ВАЖНО!

Все настройки начинайте с параметров рекомендованных заводом изготовителем. Всегда записывайте внесенные изменения и свои ощущения от пробной поездки. За один цикл делайте не более 6 «кликов» и ½ оборота регулировочного узла. За один раз настраивайте только один параметр.

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ!

Если мотоцикл чувствуется мягким и имеет тенденцию к глубоким «провалам», то недостаточно усилие демпфирования сжатия.

 

Если мотоцикл жесткий и при наезде на неровность жестко накатывается на нее, подвеска «неохотно» сжимается на неровностях, Необходимо уменьшить усилие демпфирования сжатия.

 

За один прием рекомендуется делать не более ½ оборота. После пробной поездки вносить дальнейшие изменения.

ВАЖНО!

Перед началом тонких настроек убедитесь в правильности настройки преднатяга/жесткости пружин. Простое правило, при увеличении жесткости/преднатяга пружины должно быть увеличено усилие отбоя на 2 «клика».

ВАЖНО!

Когда Вы чувствуете, что достигли желаемого изменения, обязательно вернитесь на шаг назад и проверьте свои ощущения. Обязательно обращайте внимание, при каких дополнительных условиях вас удовлетворяет работа подвески. Например давление в шинах, температура окружающего воздуха и т.п.

ВАЖНО!

Все настройки начинайте с параметров рекомендованных заводом изготовителем. Всегда записывайте внесенные изменения и свои ощущения от пробной поездки. За один цикл делайте не более 6 «кликов» и ½ оборота регулировочного узла. За один раз настраивайте только один параметр.

Когда Вы чувствуете, что достигли желаемого изменения, обязательно вернитесь на шаг назад и проверьте свои ощущения. Обязательно обращайте внимание, при каких дополнительных условиях вас удовлетворяет работа подвески. Например давление в шинах, температура окружающего воздуха и тп.

Симптом.

Очень острая реакция в поворотах (избыточная поворачиваемость) Особенно в песке.

Причина. 

Передняя часть мотоцикла ниже чем задняя. Прогиб передней подвески больше чем задней.

Действия.

Увеличить жесткость усилия сжатия передней вилки. Увеличить жесткость пружин передней вилки. Перья «просажены» в передней траверсе. (Опустить Перья в траверсе примерно на 5 мм).

 

Симптом.

Ярко выраженная недостаточная поворачиваемость мотоцикла.

Причина.

Передняя часть мотоцикла выше чем задняя. Прогиб передней подвески меньше чем у задней.

Действия.

Уменьшите усилие демпфирования передней вилки. Установить более мягкие пружины в переднюю вилку. «Просадите» перья передней вилки в траверсах на 5 мм.

 

Симптом.  

Передняя часть мотоцикла нестабильна при торможении.

Причина.

Большой прогиб передней вилки при торможении, как следствие более острый угол передней вилки.

Действия.

Уменьшить люфт камеру передней вилки. Увеличить жесткость пружин передней вилки. Увеличить усилие сжатия передней вилки.

ПЕРЕДНЯЯ ВИЛКА

Симптом. Нет полного хода передней вилки при движении. Переднее колесо жёстко «встречает» все неровности. Подвеска кажется очень жёсткой.

Действия. Уменьшить усилие сжатие передней вилки. Заменить пружины на более мягкие

 

Симптом. Подвеска слишком мягкая. Легко «срабатывает» до конца полного хода.

Действия. Уменьшить люфт камеру на 5 мм. Увеличить усилие демпфирования. Увеличить жесткость пружин.

 

Симптом. Подвеска плохо отрабатывает мелкие неровности.

Причина. Высокое усилие демпфирования передней подвески. Усилие демпфирование не достаточно прогрессивно. 

Действия. Уменьшить усилие демпфирования. Уменьшить люфт камеру.

 

Симптом. Подвеска отрабатывает мелкие неровности, но только в начале хода вилки.

Причина. Большое усилие сжатия в конце хода вилки.

Действия. Увеличить люфт камеру.

 

Симптом. Очень мягкое начало хода вилки.

Причина. Недостаточная жесткость пружина или недостаточный прелоад.

Действия. Увеличить жёсткость/ прелоад пружины.

 

Симптом. Ощущения ударов в переднюю вилку на небольших неровностях в сочетании с возможным полным ходом вилки.

Причина. Слишком сильный преднатяг пружины или большое усилие сжатия в начале хода.

Действия.  Уменьшить люфт камеру. Уменьшить преднатяг/ жесткость пружины. Очистить сальник и пыльник вилки и смазать специальной смазкой.

 

Симптом. Хорошо отрабатывает первую серию неровностей, но становится жестче после серии неровностей. Плохое сцепление на мелких неровностях.

Причина. Большое усилие отбоя. (Rebound)

Действия. Уменьшить усилие отбоя.

 

Симптом. Быстрый возврат колеса в исходное положение после сжатия.

Причина. Недостаточное усилие отбоя или излишний преднатяг пружины.

Действия. Увеличить усилие отбоя. Уменьшить преднатяг пружины.

ЗАДНЯЯ ПОДВЕСКА

Симптом. Нет полного хода задней подвески. Подвеска очень жесткая.  Плохо работает (скачет) на неровностях.

Причина. Очень большое усилие сжатия или большой преднатяг пружины.

Действия. Уменьшить усилие сжатия. Уменьшить усилие отбоя. Уменьшить преднатяг пружины. Заменить пружину на более мягкую.

 

Симптом. Подвеска полностью срабатывает, подвеска мягкая на всем ходе.

Действия. Увеличить усилие сжатия. Заменить пружину на более жесткую.

 

Симптом. Подвеска жесткая к концу полного хода, но сильно прогибается под райдером в статике.

Причина. Пружины слишком мягкие или недостаточное усилие сжатия.

Действия. Увеличить преднатяг пружины. Установить более жёсткую пружину. Проверить и настроить статический прогиб подвески.

Увеличить усилие сжатия.

 

Симптом. Заднее колесо перепрыгивает мелкие неровности при торможении или при движении под гору. Сцепление заднего колеса на «стиральной» доске недостаточно.

Причина. Слишком большой преднатяг пружины а сама пружина слишком мягкая.

Действия. Заменить пружину на более жесткую, установить преднатяг пружины на рекомендованное значение. Проверить и настроить статический прогиб подвески.

 

Симптом. Задняя подвеска плохо отрабатывает острые неровности, но неплохо работает на неровностях с пологими краями.

Причина. Большое усилие сжатия.

Действия. Уменьшить усилие сжатия.

 

Симптом. Работа задней подвески ухудшается после серии неровностей. Плохое сцепление на «стиральной доске» и при ускорении и при замедлении.

Причина. Высокое усилие отбоя.

Действия. Уменьшить усилие отбоя.

 

Симптом. Задняя часть мотоцикла очень нестабильна. Амортизатор не реагирует на настройки. Амортизатор плохо гасит колебания.

Причина. Нет давления газа. Не качественное масло или недостаточный уровень масла. Разрушение внутренних элементов амортизатора

ВАЖНО!

Когда Вы чувствуете, что достигли желаемого изменения, обязательно вернитесь на шаг назад и проверьте свои ощущения. Обязательно обращайте внимание, при каких дополнительных условиях вас удовлетворяет работа подвески. Например давление в шинах, температура окружающего воздуха и т.п.

Кривые выживаемости клеток CHO-K1, облученных 60 Co (сплошная линия) …

В последние годы особый интерес вызывают исследования, касающиеся природных, эффективных и нетоксичных соединений с радиозащитной способностью в сочетании с увеличением использования различных виды ионизирующего излучения для различных применений. Среди них прополис, смолистая смесь веществ, собранных медоносными пчелами (Apis mellifera), был признан перспективным, поскольку он обладает несколькими полезными характеристиками, т.е. е., противовоспалительное, антиканцерогенное, противомикробное и улавливающее свободные радикалы действие. Таким образом, это прямой антиоксидант, который защищает клетки и организмы от неблагоприятного воздействия ионизирующего излучения. Эти соответствующие биологические активности в основном опосредуются флавоноидами, присутствующими в относительно высоких концентрациях в прополисе. Учитывая, что химический состав и, следовательно, биологическая активность прополиса варьируется в зависимости от окружающей среды растений, настоящее исследование было проведено с целью оценки радиозащитной способности бразильского прополиса, собранного в штате Риу-Гранди-ду-Сул, против генотоксические повреждения, вызванные гамма-излучением 60 Co в клетках яичников китайского хомячка (CHO-K1).для этой цели была проанализирована индукция микроядер на предмет непоправимого повреждения, в частности, связанного с двухцепочечными разрывами ДНК, которые потенциально являются канцерогенными. Клетки CHO-K1 подвергались воздействию различных концентраций прополиса (3-33 мкг / мл) за 1 час до облучения с 1 Гр γ-излучения (0,722 Гр / мин). Полученные данные показали тенденцию к снижению количества радиоиндуцированных повреждений на клетках, ранее обработанных прополисом. Радиозащитный эффект был более заметным при более высокой концентрации прополиса.Обработка одним прополисом не вызывала генотоксических эффектов на клетки CHO-K1. Кроме того, лечение прополисом, связанное или не связанное с радиацией, не влияло на кинетику клеточной пролиферации.

(PDF) Генотоксическое и цитотоксическое действие γ-лучей Co и β-лучей Sr / Y на клетки яичников китайского хомячка (CHO-K1)

Благодарности Авторы благодарны г-ну Маркосу

Xavier, Centro de Metrologia das Радиацес, IPEN – CNEN / SP,

Бразилия, за его помощь с

90

Sr /

90

Калибровка дозы Y и облучение образца крови

.D.M. был поддержан CAPES.

Ссылки

1. Ленгауэр С., Кинзлер К.В., Фогельштейн Б. (1998) Genetic insta-

способностей при раке человека. Nature 396: 643–649

2. Ward JF (1985) Биохимия повреждений ДНК. Radiat Res

104: S103 – S111

3. Lewington VJ (1993) Целенаправленная радионуклидная терапия при метастазах в кости

. Eur J Nucl Med 20: 66–74

4. Аллен Б.Дж., Благоевич Н. (1996) Альфа- и бета-излучающие радиоактивные

олантаноиды

в таргетной терапии рака: потенциальная роль

тербия-149.Nucl Med Commun 17: 40–47

5. Регулла Д.Ф. (1986) Важность воздействия бета-частиц в

практической радиационной защите. Radiat Prot Dosim 14: 95–100

6. Vulpis N (1984) Индукция хромосомных аберраций в

лимфоцитах человека при облучении in vitro b-частицами из

воды, меченной тритием. Radiat Res 97: 511–518

7. Танака К., Савада С., Камада Н. (1994) Относительная биологическая

эффективность и мощность дозы тритированной воды на хромосомы

в лимфоцитах и ​​клетках костного мозга человека.Radiat

Res 323: 53–61

8. Deng W, Morrison DP, Gale KL, Lucas JN (1998) Биологическая дозиметрия

бета-излучения трития с использованием транслокаций хромосомы

в лимфоцитах человека, проанализированных с помощью флуоресценции

гибридизация in situ. Radiat Res 150: 400–405

9. M’Kacher R, Legal JD, Schlumberger M, Voisin P, Aubert B,

Gaillard N, Parmentier C (1996) Биологическая дозиметрия у пациентов, получавших йод-

пациентов. 131 для дифференцированного рака щитовидной железы —

нома.J Nucl Med 37: 1860–1864

10. Wuttke K, Streffer C, Muller WU, Reiners C., Biko J, Demid-

chik E (1996) Микроядра в лимфоцитах детей из

окрестностей Чернобыля до и после

131

I терапия рака щитовидной железы

. Int J Radiat Biol 69: 259–268

11. Gutierrez S, Carbonell E, Galofr P, Creus A, Marcos R (1997)

Индукция микронуклеаров с помощью

131

I Воздействие: исследование гипертиреоза —

пациенты изм.Mutat Res 373: 39–45

12. Ватанабэ Н., Йокояма К., Кинуя С. и др. (1998) Radiotoxi-

city после терапии метастазами в кости стронцием-89 с использованием микроядерного анализа

. J Nucl Med 39: 2077–2079

13. Сильва М.А. да, Сузуки М.Ф., Гимареш М.И. и др. (2002) Com-

, паративное исследование цитогенетических эффектов in vivo и in vitro

из

153

Sm-EDTMP в лимфоцитах пациентов с костными метастазами

. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 48: 493–499

14.Suzuki MF, Silva MA da, Murakami D, Guimar¼es MI,

Okazaki K (2002) Индукция микроядер

153

Sm-EDTMP

в лимфоцитах пациентов с костными метастазами. Cell Mol Biol

(Noisy-le-grand) 48: 487–492

15. Милл А.Дж., Уэллс Дж., Холл С.К., Батлер А. (1996) Дукция микронуклеусов в лимфоцитах человека: сравнительный эффект рентгеновских лучей. ,

альфа-частицы, бета-частицы и нейтроны и их значение для

биологической дозиметрии.Radiat Res 145: 575–585

16. Вульпис Н., Скарпа Г. (1986) Индукция хромосомных аберраций

с помощью

90

частиц Sr b в культивируемых лимфоцитах человека. Mutat

Res 163: 277–283

17. Холл С., Уэллс Дж. (1988) Микроядра в лимфоцитах человека как биологический дозиметр

: предварительные данные после бета-облучения-

in vitro. J Radiol Prot 8: 97–102

18. Oliveira EM, Suzuki MF, Nascimento PA, Silva MA da,

Okazaki K (2001) Оценка воздействия

90

Sr b-излучения на

человека клетки крови с помощью хромосомной аберрации и одноклеточного электрофореза

(анализ комет).Mutat Res 476: 109–

121

19. Дин Б.Дж., Дэнфорд Н. (1984) Анализы для обнаружения

химически индуцированных повреждений хромосом в культивируемых клетках млекопитающих

. В: Venitt S, Parry JM (eds) Тестирование мутагенности:

практический подход. IRL Press, Oxford, pp. 187–232

20. Guo M, Chen C, Vidair C., Marino S, Dewey WC, Ling CC

(1997) Характеристика радиационно-индуцированного апоптоза в клеточных линиях ro-

dent. Radiat Res 147: 295–303

21.Johnston PJ, Stoppard E, Bryant PE (1997) Индукция и распространение повреждений в CHO-K1 и чувствительной к рентгеновскому излучению ham-

стерильной клеточной линии xrs5, измеренной с помощью цитохалазин-B-цитокинеза

блока micronucleus анализ. Mutat Res 385: 1–12

22. Chapman JD, Stobbe CC, Gales T., Das IJ, Zellmer DL, Brade

S, Matsumoto Y (1999) Конденсированный хроматин и инактивация клеток —

по кинетике однократного попадания . Radiat Res 151: 433–441

23. Chang WP, Little JB (1991) Отсроченная репродуктивная гибель в

рентгеновских облученных клетках яичников китайского хомячка.Int J Radiat Biol

60: 483–496

24. Dominguez I, Boei JJ, Balajee AS, Natarajan AT (1996)

Анализ радиационно-индуцированных хромосомных аберраций в

клетках китайского хомячка методом FISH с использованием хромосом-специфических

библиотеки ДНК. Int J Radiat Biol 70: 199–208

25. Bartkowiak D, Hgner S, Nothdurft W., Rttinger EM (2001)

Клеточный цикл и ростовая реакция клеток CHO на рентгеновское облучение:

порог- бесплатный ремонт при малых дозах.Int J Radiat Oncol Biol Phys

50: 221–227

26. Yasui LS (1992) Цитотоксичность

125

I распад в ДНК двойной

разрыв цепи мутантная линия клеток xrs-5, дефицитная по репарации. Int J Radiat

Biol 62: 613–618

27. Hoper KG, Bao SP (1995) Излучение с низкой и высокой ЛПЭ

действие

125

I распадается в ДНК: влияние цистеамина на микро —

Образование

ядра и уничтожение клеток. Radiat Res 141: 183–192

28.Shadley JD, Whitlock JL, Rotmensch J, Atcher RW, Tang J,

Schwartz JL (1991) Эффекты облучения дочерними частицами радона

в линиях клеток K1 и xrs-5 CHO. Mutat Res 248: 73–

83

29. Нельсон Дж. М., Брукс А. Л., Метлинг Н. Ф. и др. (1996) Clastogenic

эффекты определенного количества альфа-частиц 3,2 МэВ на отдельные клетки CHO-K1 in-

. Radiat Res 145: 568–574

30. Schwartz JL, Ashman CR, Atcher RW et al. (1991) Дифференциальная чувствительность локуса

к индукции мутации ионизирующим излучением

различных LET в клетках K1 яичника китайского хомячка.Carcino-

genesis 12: 1721–1726

31. Trott KR, Jamali M, Manti I, Teibe A (1998) Проявления

и механизмы радиационно-индуцированной геномной нестабильности в клетках китайского хомячка

V-79. Int J Radiat Biol 74: 787–791

32. Дикомей Э., Францке Дж. (1986) Три класса разрывов цепи ДНК

, индуцированных рентгеновским облучением и внутренними b-лучами. Int J Radiat

Biol 50: 893–908

33. Dikomey E (1988) Влияние мощности дозы на уничтожение клеток и восстановление разрыва цепи ДНК

в клетках CHO, подвергшихся воздействию внутренних b-лучей

из инкорпорированных [

] 3

H] тимидин.Int J Radiat Biol 53: 667–678

34. Фенек М., Кротт Дж., Тернер Дж., Браун С. (1999) Некроз, апоп-

, тоз

, цитостаз и повреждение ДНК в лимфоцитах человека

, измеренные одновременно в цитокинезе. block micro-

ядерный анализ: описание метода и результаты для пероксида водорода

. Мутагенез 14: 605–612

35. Szumiel I (1994) Гибель клеток, вызванная ионизирующим излучением. Int J

Radiat Biol 66: 329–341

36.Kirsch-Volders M, Elhajouji A, Cundari E, Hummelen PV

(1997) Микронуклеусный тест in vitro: анализ с несколькими конечными точками для

одновременно обнаруживает митотическую задержку, апоптоз, разрыв хромосомы

, потерю хромосом и неразрывность . Mutat Res

392: 19–30

37. Hall EJ (2000) Кривые выживаемости клеток. В: Hall EJ (ed) Radiobi-

ology для радиолога, 5-е изд. JB Lippincott, Philadelphia,

pp 32–50

38. Guo GZ, Sasai K, Oya N, Takagi T, Shibuya K, Hiraoka M

(1998) Одновременная оценка радиационно-индуцированного апоптоза

и пяти микронуклеаров Сотовые линии.Int J Radiat Biol 73: 297–302

39. Erexson GL, Kligerman AD, Halperin EC, Honore GM, Allen

JW (1989) Микроядра в двуядерных лимфоцитах мышей

после воздействия гамма-излучения. Environ Mol Mutagen

13: 128–132

40. Горман А., Маккарти Дж., Финукейн Д., Ревилл В., Коттер Т.Г.

(1996) Морфологическая оценка апоптоза. In: Cotter TG,

98

Обогащение микросом из клеток яичников китайского хомячка путем субклеточного фракционирования для использования в протеомном анализе

Abstract

Клетки яичников китайского хомячка являются «рабочей лошадкой» для производства рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Поскольку на биохимические, клеточные и омические исследования обычно влияет отсутствие подходящих процедур фракционирования для выделения компартментов из этих клеток, методы дифференциального и изопикнического центрифугирования были охарактеризованы и разработаны специально для них. Обогащенные фракции в интактных ядрах, митохондриях, пероксисомах, цис, -Гольджи, транс, -Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме (ER) получали на стадиях дифференциального центрифугирования и впоследствии разделяли в прерывистых градиентах сахарозы.Ядра, митохондрии, цис, -Гольджи, пероксисомы и гладкие фракции ER были получены в виде определенных полос в 30-60% градиентах. Несмотря на низкий процент микросом от общего гомогената клеток (1,7%), их разделение в новом градиенте сахарозы (10–60%) показало достаточное разрешение и эффективность для количественного разделения их компонентов на фракции, обогащенные транс -Гольджи. , цис -Гольджи и ER. Принадлежность этих органелл к классическому пути секреции, происходящему от 10-60% градиентов, была подтверждена протеомикой. Данные доступны через ProteomeXchange с идентификатором PXD019778. Компоненты ER и плазматической мембраны были наиболее частыми контаминантами почти во всех полученных фракциях. Улучшенный градиент сахарозы для микросомальных образцов оказался успешным в получении обогащенных фракций органелл с низким содержанием, таких как аппарат Гольджи и компоненты ER, для биохимических и молекулярных исследований, а также пригоден для протеомных исследований, что делает его полезным инструментом для будущих исследований этого и другие клеточные линии млекопитающих.

Образец цитирования: Перес-Родригес С., де Хесус Рамирес-Лира М., Вульф Т., Волдбор Б.Г., Рамирес О.Т., Трухильо-Рольдан М.А. и др. (2020) Обогащение микросом из клеток яичника китайского хомячка путем субклеточного фракционирования для использования в протеомном анализе. PLoS ONE 15 (8):
e0237930.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930

Редактор: Иоскани Хименес дель Валь, Университетский колледж Дублина, ИРЛАНДИЯ

Поступило: 3 марта 2020 г . ; Одобрена: 6 августа 2020 г .; Опубликовано: 25 августа 2020 г.

Авторские права: © 2020 Pérez-Rodriguez et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Саумель Перес-Родригес — докторант Программы докторантуры в области биомедицины, Национальный автономный университет Мексики (UNAM) и получила стипендию номер 396822 от КОНАСИТ.Этот проект был разработан в рамках институциональной программы Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM: «La producción de biomoléculas de interés biomédico en bacterias y hongos». Эта работа была поддержана «Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Universidad Nacional Autónoma de México» (PAPIIT-UNAM IN210419: NAVC, IT-200719: MATR, IN-208415: NAVC). Работа, проделанная в Центре биологической устойчивости Novo Nordisk Foundation, была основана фондом Novo Nordisk (NNF10CC1016517: TW и BGV).GE Healthcare Life Sciences оказала поддержку в области сред и материалов для культивирования клеток, компания GeneTex предоставила щедрый подарок в виде антител, а д-р Паола Толедо Ибеллес из Inolab Especialistas en Servicio предоставила поддержку в области среды для культивирования клеток. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: GE Healthcare Life Sciences оказала поддержку в области среды и материалов для клеточных культур, GeneTex предоставила щедрый подарок антител, а Dr.Паола Толедо Ибеллес из Inolab Especialistas en Servicio оказала поддержку в области среды для культивирования клеток. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно декларировать. Это не влияет на нашу приверженность политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Субклеточное фракционирование клеток млекопитающих применялось для изучения морфологии, состава, структуры и взаимодействий между органеллами [1–3], клеточной и молекулярной биологии [4] и, в последнее время, клеточного состава с помощью омических подходов [ 5–7].Некоторые преимущества фракционирования включают изучение клеточных процессов in vitro [8–11], отслеживание белков [12], анализ посттрансляционных модификаций (PTM) [13] и состав белков [6,14,15]. Хотя для субклеточного фракционирования были разработаны разные протоколы [16-19], универсальный протокол неосуществим из-за различий в структуре и взаимодействиях органелл, а также в устройстве цитоскелета, которое привело к модификациям для каждой конкретной ткани или клеточной линии.

Суспензия Клетки яичника китайского хомячка (СНО) являются наиболее часто используемым млекопитающим-хозяином для продукции рекомбинантных гликопротеинов; с 2015 по 2018 год в этих клетках было произведено около 84% одобренных антител [20]. Учитывая высокую биофармацевтическую ценность этой линии клеток, стандартизация и оптимизация конкретных протоколов фракционирования имеют решающее значение для получения более глубоких знаний, которые приводят к разработке новых подлиний с улучшенными возможностями для продукции рекомбинантного белка.Однако сообщалось о нескольких протоколах фракционирования для этих клеток в их суспензионном формате. С другой стороны, как о сверхпродуцентах рекомбинантных белков, на сегодняшний день сообщается о 150 опубликованных статьях, в которых используются протоколы фракционирования, ориентированные только на выделение одной или нескольких органелл с прикрепленным фенотипом [9,21–26]. В этих статьях использовались клетки СНО дикого типа и мутантные клетки СНО для изучения везикулярного транспорта [9,21], липидного состава плазматической мембраны (ПМ) [22], биогенеза пероксисом [25] и субклеточного распределения белка nsL-TP. [26]; и для выделения мембран Гольджи, ПМ, эндоплазматического ретикулума (ЭР), ядер, митохондрий и лизосом [23,24].

Высокая перекрестная контаминация фракций, обогащенных PM, аппарата Гольджи, ER, лизосом [23] и пероксисом [25] из-за недостаточных стадий фракционирования без применения какой-либо дополнительной методологии, препятствует использованию некоторых из этих протоколов для таких приложений, как протеомика . Однако фракционирование в сочетании с ресурсами изобарического и метаболического мечения и биоинформатики позволяет проводить протеомный анализ и однозначное отнесение клеточных белков к органеллярным компартментам, даже при ожидаемом перекрестном загрязнении [27-30].Несмотря на доступность протоколов, эти методики являются технически сложными, и для некоторых компартментов, таких как путь секреции, может наблюдаться низкое разделение между ER, аппаратом Гольджи и промежуточным компартментом ER-Golgi (ERGIC).

Следовательно, целью настоящего исследования было разработать и охарактеризовать протокол субклеточного фракционирования рекомбинантных клеток СНО, выращенных в суспензии, посредством дифференциального и изопикнического центрифугирования, чтобы получить обогащенные фракции большинства органелл для изучения их биологии. Поскольку классический путь секреции часто может стать узким местом для увеличения экспрессии рекомбинантных белков в клетках CHO [31–33], мы сосредоточились на разделении его компонентов с помощью изопикнического центрифугирования. Обогащение и изоляция ER и аппарата Гольджи были улучшены по сравнению с предыдущим протоколом [13], благодаря разработке нового прерывистого градиента сахарозы, который может быть расширен до отделения компонентов микросом от других линий клеток млекопитающих. Этот градиент также может быть использован для сравнительного протеомного исследования органелл классического пути секреции в различных экспериментальных условиях культивирования или клеточных фенотипах.

Материалы и методы

Клеточная линия и условия культивирования

CHO DP-12 clone # 1933 ATCC® CRL-12444 TM [34] культивировали в среде CDM4CHO (Hyclone, UT, USA) с добавлением 6 мМ стабильного глутамина (Biowest LLC, MO, USA), 0,002 мг / мл. Хумулин N (Эли Лилли, Индиана, США) и 200 нМ метотрексата (Pfizer, Нью-Йорк, США) при 37ºC в атмосфере 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе. Клетки высевали в двух экземплярах с концентрацией 0,5 × 10 6 клеток / мл и жизнеспособностью выше 95% в 35 мл среды в колбах Эрленмейера на 250 мл при 60 об / мин (Bellco Glass, NJ, США).Концентрацию и жизнеспособность клеток регистрировали каждые 24 часа путем подсчета клеток в камере Нойбауэра с использованием метода исключения красителя трипанового синего.

Гомогенизация клеток

Протокол субклеточного фракционирования клеток СНО доступен по адресу Protocol.io (dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bf9sjr6e). Клетки центрифугировали при 185 x g в течение 5 минут и дважды промывали холодным фосфатным буфером (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na 2 HPO 4 , 1,8 мМ KH 2 PO 4 ).Осадок суспендировали при 6,6 × 10 7 клеток / мл в буфере HEPES (1 мМ EDTA, 10 мМ HEPES, pH 7,4) и инкубировали в течение 30 минут на льду. К суспензии добавляли 1 мМ PMSF и 10% (об. / Об.) Коктейль ингибиторов протеазы SigmaFast (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Клетки разбивали 25 ударами в гомогенизаторе Даунса, после чего добавляли сахарозу в концентрации 0,25 М для восстановления осмолярности.

Дифференциальное центрифугирование

Гомогенат был распределен в 1.Пробирки на 5 мл по 1 мл на пробирку и осадки, собранные при 3000 x g в течение 10 минут, 9000 x g в течение 15 минут и 100000 x g в течение одного часа, были названы ядерными, митохондриальными и микросомальными, соответственно. Супернатант от последнего центрифугирования был назван цитозолем [35,36]. Тонкостенные полипропиленовые пробирки с открытым верхом, 14 x 89 мм, использовали для всех стадий ультрацентрифугирования при скоростях ≥ 100 000 x g. Гранулы солюбилизировали в буфере для изоэлектрической фокусировки (IEF, 7 M мочевина, 2 M тиомочевина, 2% [мас. / Об.] CHAPS, 40 мМ дитиотреитол) для характеристики дифференциального центрифугирования.В противном случае гранулы хранили на льду для их дальнейшего разделения в градиентах сахарозы.

Изопикническое центрифугирование

Ядерные, митохондриальные и микросомальные осадки разбавляли 0,25 М сахарозой, наносили поверх градиентов и центрифугировали в среднем 154 693 x g в течение 3 ч (ультрацентрифуга Optima XE, Beckman Coulter, IN, США). Предыдущий градиент [35] был адаптирован для ядерных и митохондриальных суспензий, состоящих из 1 мл 60% (мас. / Об.) И 3 мл каждого из следующих растворов: 55, 40 и 30% (мас. / Об.) Сахарозы.Препараты микросом разделяли в двух разных градиентах. Первый был адаптирован из литературы [13] к 1 мл каждого из следующих растворов: 60, 45, 40, 35, 30, 25, 20 и 15% (мас. / Об.) Сахарозы. Второй, разработанный в компании, состоял из 1 мл 60% (мас. / Об.) И 2,5 мл каждого из следующих растворов: 45, 35, 30 и 10% (мас. / Об.) Сахарозы. Видимые полосы или фракции по 500 мкл собирали для дальнейшей характеристики.

Определение концентрации белка и сахарозы

Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда в 96-луночных микропланшетах с использованием концентрата красителя (Bio-Rad, Калифорния, США) в соответствии с рекомендациями производителя.В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (GE Healthcare Bio-Sciences, Массачусетс, США), а образцы в буфере IEF разбавляли водой в 5 раз. Концентрацию сахарозы измеряли на ручном рефрактометре 0–32% Brix.

SDS-PAGE

Образцы смешивали с буфером Лэммли [37], инкубировали при 95ºC в течение 5 минут, центрифугировали при 16000 x g в течение 5 минут и наносили на 12% или 15% SDS-полиакриламидные гели. Образцы, предварительно разведенные в буфере IEF, не нагревали. В качестве маркера молекулярной массы использовали предварительно окрашенную белковую лестницу Page Ruler (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США).Электрофоретическое разрешение было достигнуто в системе SE260 Mini Vertical Protein Electrophoresis System (Hoefer Inc., Массачусетс, США) с использованием трис-глицина (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 0,1% [вес / объем] SDS, pH 8,3) в качестве рабочего буфера. . Гели окрашивали кумасси бриллиантовым синим G 250 (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Дармштадт, Германия), а изображения получали в тепловизоре Gel DocTM EZ (Bio-Rad, Калифорния, США).

Идентификация вестерн-блоттинга (WB)

Протокол обнаружения эталонных белковых маркеров с помощью WB, ELISA и ферментативных анализов доступен в протоколах. io (dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bgc4jsyw) и информацию об антителах в таблице S1. Обогащение ER, цитозолем, ядром, митохондриями, PM, цис--Гольджи и транс--Гольджи оценивали путем обнаружения белков Grp78, Gapdh, гистона h4, Hsp60, флотилина 1, голгина А5 и голгина-97 соответственно. . Мембраны выявляли с помощью набора SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) и изображений, полученных с помощью сканера вестерн-блоттинга LI-COR C-DiGit Chemiluminescence (LI-COR Biosciences, NE, США).

Grp78, Gapdh и гистон h4 идентифицировали с помощью коктейля вестерн-блоттинга фракции эндоплазматической ретикулума 250X и коктейля вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) (ab139415, Abcam, Cambridge, MA, USA), разведенных в 2000 и 2500 раз соответственно.

Для голгина-97 первичное антитело (GTX114445, GeneTex, Калифорния, США) и антикроличий IgG, конъюгированный с HRP (ab205718, Abcam, Cambridge, MA, USA), оба разбавляли в 2000 раз. Антифлотилин 1 (GTX104769, GeneTex, Калифорния, США), анти-Hsp60 (GTX110089, GeneTex, Калифорния, США) и анти-голгин A5 (GTX104255, GeneTex, CA, США) разводили в 2000, 10000 и 2000 раз соответственно.

ELISA против голгина-97

Golgin-97 также был количественно определен с помощью ELISA в образцах от дифференциального центрифугирования с использованием оптимизированного протокола. Планшеты с высоким связыванием (Greiner Bio-One GmbH, Австрия) покрывали 4 мкг белков из солюбилизированных гранул и гомогенатов клеток Escherichia coli и CHO в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере натрия, pH 9,6, в течение 16 часов при температуре окружающей среды. 4ºC. Лунки блокировали 1% (мас. / Об.) Бычьим сывороточным альбумином и 0,05% твин-20 в фосфатном буфере.Затем планшет инкубировали с антителами против голгина-97 и кроличьими IgG, конъюгированными с HRP, разведенными в 2000 и 1000 раз соответственно. Субстрат SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich, Merck KGaA, Дармштадт, Германия) готовили в соответствии с рекомендациями производителя и инкубировали в течение 15 мин. Реакцию останавливали 10% (об. / Об.) HCl и регистрировали оптическую плотность при 490 нм. E . coli и лизаты клеток CHO были выбраны в качестве отрицательного и положительного контролей соответственно.

Обработка изображений и количественная оценка

изображений WB были обработаны с помощью ImageJ v1.52а (Национальные институты здоровья, Мэриленд, США). Обогащение после дифференциального центрифугирования, выраженное как кратное изменение, представляло собой отношение площадей белкового маркера между каждой фракцией и гомогенатом.

Для градиентов 15–60% обогащение рассчитывали двумя разными способами. Когда все фракции присутствовали на одной и той же мембране, это было соотношение между площадью белкового маркера и общим количеством белков, нанесенных на дорожку. Когда фракции распределялись по разным мембранам, гомогенат функционировал как внутренний контроль, и рассчитывалось соотношение между площадями белкового маркера и гомогената. Это соотношение умножали на среднюю площадь гомогенатов, чтобы получить нормализованную площадь белкового маркера. Наконец, обогащение рассчитывали как отношение между нормализованной площадью белкового маркера и общей концентрацией белков, нанесенных на дорожку. Для градиентов 10–60% и 30–60% обогащение выражали как отношение между площадью маркера белка и общим количеством белков, нанесенных на дорожку.

Анализ каталазы

Обогащение пероксисом оценивали с помощью анализа каталазы, адаптированного из Iwase, et al. .[38]. Двадцать микролитров образцов смешивали с 30 мкл 50 мМ фосфатного буфера (21 мМ KH 2 PO 4 , 29 мМ K 2 HPO 4 , pH 7,0) и 50 мкл 1% (v / v) Тритон Х-100 и помещенный в стеклянную пробирку 12×75 мм. Добавляли пятьдесят микролитров 30% (об. / Об.) Перекиси водорода и перемешивали. Удельную активность каталазы измеряли как отношение между высотой пены (мм) после 5 мин инкубации и количеством белка, добавленного в пробирку (мг).

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

осадков зафиксировано в 2.5% (об. / Об.) Глутарового альдегида и после фиксации в 1% (мас. / Об.) Четырехокиси осмия. Сахарозу отмывали разбавлением фосфатным буфером с последующим ультрацентрифугированием. Осадки обезвоживали в растворах этанола и инкубировали в чистом ацетонитриле. Образцы заливали свежеприготовленной смолой Epon [39], разрезали на ультрамикротоме Reichert-Jung и подвергали двойному контрастированию. Изображения получали в просвечивающем электронном микроскопе JEOL-1200 EX II.

Протеомная характеристика микросом с градиентом 10–60% сахарозы

Белковые полосы из градиентов 10–60% сахарозы осаждали ацетоном в соответствии с предыдущими рекомендациями [40].Гранулы солюбилизировали в гуанидиниевом буфере (6 М гидрохлорид гуанидиния, 5 мМ трис [2-карбоксиэтил] фосфин, 10 мМ хлорацетамид, 100 мМ трис-HCl, pH 8,5), инкубировали при 99 ° C в течение 10 минут и трипсинизировали в течение ночи [41]. Реакцию останавливали с помощью 0,5% (об. / Об.) Трифторуксусной кислоты и 20 мкг расщепленных пептидов подвергали стадии обработки согласно Rappsilber, J. et al. . [42]. Система UltiMate 3000 RSLCnano с капиллярным потоком (capLC, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США), соединенная с колонкой для легкого распыления C18 диаметром 15 см, 50 мкм x 150 мм, 2 мкм, Acclaim PepMap C18, использовалась при скорости потока 1.2 мкл / мин (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) в ступенчатом градиенте (3–45% ацетонитрила). Образцы распыляли в масс-спектрометр Q-Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США), работающий в режиме сбора данных в зависимости от данных. Полное сканирование было собрано с разрешением 60 000; AGC Target 3.0e6; максимальное время впрыска 50 мс, за которым следуют до 12 сканирований MS2 с разрешением 15000, максимальное время впрыска 30 мс, энергия столкновения HCD 28% и динамическое исключение 25 секунд. Во время анализа MaxQuant карбамидометил (C) и окисление метиониновых остатков были установлены как фиксированные и переменные модификации, соответственно; было разрешено одно пропущенное расщепление, а уровень ложного обнаружения был установлен на 1%. Протеом СНО (UP000001075) использовался в качестве ссылки, включая список известных загрязняющих веществ. Допуск был установлен на уровне 20 частей на миллион. Данные масс-спектрометрической протеомики были депонированы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE [43] с идентификатором набора данных PXD019778.

Загрязняющие вещества и группы, идентифицированные в обратной базе данных или с помощью PTM, были отброшены. Белки были сопоставлены с протеомом Mus musculus (UP000000589) [44] и классифицированы с помощью PANTHER v14.0 [45,46] и ресурсы DAVID v6.8 [47,48]. Диаграммы Венна были созданы с помощью веб-инструмента VENNY v2.1 [49].

Статистический анализ

Ранговый тест Краскела-Уоллиса и апостериорный тест Коновера с поправкой Бонферрони на языке R были использованы для выявления значительных статистических различий в распределении эталонных белков между субклеточными фракциями [50,51]. Выбранный уровень значимости соответствует значению p <0,05.

Результаты

Обогащение ядер, митохондрий, микросом и цитозоля путем дифференциального центрифугирования

клеток СНО, отобранных во время фазы экспоненциального роста (S1 фиг.), Были механически разрушены, и субклеточные компартменты были выделены с помощью дифференциального центрифугирования, из которого были собраны ядерные, митохондриальные и микросомальные осадки, а также цитозоль.SDS-PAGE показал различную структуру белка во всех собранных образцах (S2 фиг.) С максимальным количеством белков 15 кДа в ядерном осадке.

Обогащение Grp78, гистона h4, Gapdh, Hsp60, флотилина 1, голгина A5 и голгина-97 в качестве маркеров ER, ядра, цитозоля, митохондрий, PM, транс -Гольджи и цис -Гольджи, соответственно. подтверждено WB и ELISA (фиг. 1 и S3 фиг.), без статистических различий, обнаруженных в этих анализах (p> 0,05). Самая высокая концентрация гистона h4 и Gapdh наблюдалась в ядерном осадке и цитозоле соответственно.Hsp60 в основном концентрировался в ядерных и митохондриальных гранулах, флотилин 1 и голгин А5 — в митохондриальных и микросомальных гранулах, а голгин-97 — в микросомальных гранулах и цитозоле. Grp78 был распределен среди всех гранул с более высокой концентрацией в микросомальном.

Рис. 1. Количественное определение белковых маркеров вестерн-блоттингом при дифференциальном центрифугировании.

Grp78, Gapdh, гистон h4, Hsp60, флотилин 1, голгин A5 и голгин-97 были выбраны в качестве маркеров эндоплазматического ретикулума, цитозоля, ядра, митохондрий, плазматической мембраны, цис, -Гольджи и транс -Гольджи, соответственно. .Обогащение Golgin-97 было подтверждено с помощью ELISA, как показано на вставке. HM: гомогенат, N, MT, MC: ядерные, митохондриальные и микросомальные преципитаты, CT: цитозоль. Модель E . Гомогенат coli использовали в качестве отрицательного контроля (NC) для проверки любого неспецифического распознавания. Стандартное отклонение рассчитывали из двух биологических повторов. Статистических различий по рангам тестом Краскела-Уоллиса не выявлено.

https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0237930.g001

Морфологическая характеристика показала, что интактные ядра были обогащены ядерным осадком (рис. 2A) вместе с митохондриями, ER и пузырьками, которые оставались заключенными в большие структуры вокруг ядер (рис. 2D). Обильные митохондрии, везикулы разной плотности, тубулярные структуры (TS) и цистерны (Cs) были обнаружены в митохондриальном осадке (рис. 2B-2E), тогда как микросомы состоят только из TS, пузырьков и Cs (рис. 2C-2F). Неожиданно Cs было больше в митохондриях, чем в микросомальном образце.Количественное определение белка показало, что почти все содержание клеточного белка происходило из ядерного осадка и цитозоля, с низким представлением митохондриальных и микросомальных белков (таблица S2).

Рис. 2. Электронно-микроскопические характеристики образцов после дифференциального центрифугирования.

Изображения ядерных (A, D), митохондриальных (B, E) и микросомальных (C, F) гранул были получены после фиксации, окрашивания и включения. В соответствии с их морфологией структуры были классифицированы как ядро ​​(N), митохондрии (MT), тубулярная структура (TS), цистерны (Cs), эндоплазматический ретикулум (ER), а также везикулы с низкой, средней и высокой электродностью (LDV, MDV и HDV. , соответственно).Для каждого образца были показаны два репрезентативных изображения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.g002

Разделение и обогащение органелл изопикническим центрифугированием

Дифференциальное фракционирование — это быстрый, простой и эффективный метод выделения неочищенных фракций клеточных органелл. Однако более эффективное выделение и более высокая степень обогащения могут быть получены путем разделения осадков дифференциального центрифугирования в градиентах плотности.Таким образом, ядерные и митохондриальные гранулы были впоследствии разделены в градиентах 30–60% сахарозы, в то время как для микросомального преципитата оценивалась эффективность двух различных градиентов сахарозы (15–60% и 10–60%).

Обогащение

транс, -Гольджи, цис, -Гольджи и ER в градиенте 15–60%.

Разделение и обогащение микросом сначала оценивали в градиенте 15–60%, где наблюдались три пика белка (P1-P3), которые соответствовали видимым полосам (S4A и S4B, рис. ), С частичным перекрытием между P1 и P2.Загрязнение Gapdh (рис. 3B) и гистоном h4 (рис. 3C, p≤0,05) присутствовало во фракциях с более низкой плотностью (от 6 до 8), тогда как флотилин 1 в основном ассоциировался с фракциями средней плотности (рис. 3D, p≤0,05). Большое увеличение интенсивности голгина-97 в P1 (фиг. 3F), голгина A5 в P2 (фиг. 3E, p≤0,05) и Grp78 в P3 (фиг. 3A) указывает на то, что эти фракции преимущественно принадлежали к транс -Golgi, цис -Гольджи и ER, соответственно, как показано на Вестерн-блоттинге (S5 Фиг.). Количественное определение белка в соответствии с SDS-PAGE (S4C и S4D фиг.) Показало, что цис, -Гольджи (1.37 ± 0,01%) был более обильным, чем транс -Гольджи (0,59 ± 0,14%) и ER (0,85 ± 0,18%).

Рис. 3. Вестерн-блоттинг микросом с градиентом 15–60%.

Обогащение Grp78 (A), гистона h4 (C), Gapdh (B), флотилина 1 (D), голгина A5 (E) и голгина-97 (F) определяли количественно с помощью вестерн-блоттинга во фракциях, собранных и пронумерованных из сверху вниз трубки (ось x). Стандартное отклонение рассчитывали из двух биологических повторов. Разные буквы указывают на статистические различия (p≤0.05) согласно ранговому тесту Краскела-Уоллиса и Post-hoc-тесту Коновера с поправкой Бонферрони, напротив, фракции, имеющие хотя бы одну букву, существенно не отличаются друг от друга.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.g003

Обогащение

транс, -Гольджи, цис, -Гольджи и ER в градиенте 10–60%.

Учитывая низкий процент микросомальных белков в клеточном гомогенате, важно максимизировать разделение и обогащение микросомальных компонентов, вероятно, за счет эффективного градиента сахарозы.Это, в сочетании с тем фактом, что наблюдалось частичное перекрытие доменов Гольджи при градиенте 15–60%, привело к разработке и описанию нового градиента 10–60% в нашей лаборатории.

После разделения в этом новом градиенте наблюдались три полосы большей видимости, четкости и разрешения. Эти полосы совпадали с пиками концентрации белка (P7-P9) и с резким увеличением концентрации сахарозы (S6C на фиг. ). Голгин-97 в основном обнаружен в P7, области микросом низкой плотности, в то время как голгин A5 мигрировал в зоны средней и высокой плотности (p≤0.05), а Grp78 был локализован на пике P9, фракции с самой высокой плотностью. Основное загрязнение, представленное флотилином 1, наблюдалось в основном в областях со средней и низкой плотностью (рис. 4 и S7, рис., P≤0,05).

Рис. 4. Вестерн-блоттинг градиентов 30–60% и 10–60% сахарозы.

Пики белков были собраны в градиентах 30–60% ядер (P1-P3), 30–60% митохондрий (P4-P6) и 10–60% микросом (P7-P9) и пронумерованы сверху вниз. трубка. Обогащение Grp78, гистоном h4, Gapdh, Hsp60, флотилином 1, голгином А5 и голгином-97 определяли количественно с помощью вестерн-блоттинга.Стандартное отклонение рассчитывали из двух биологических повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.g004

P7 состоял почти исключительно из везикул с низкой электродной плотностью (LDV) (рис. 5A), которые вместе с везикулами со средней электродной плотностью (MDV), TS и Cs также присутствовал в P8 (рис. 5B). Обилие TS, MDV и везикул высокой плотности (HDV) увеличилось в P9 (рис. 5C). Эти морфологические характеристики вместе с результатами WB показали обогащение транс -Гольджи, цис -Гольджи и ER во фракциях P7-P9, соответственно.

Рис. 5. Электронно-микроскопическое исследование микросом в градиентах 10–60% сахарозы.

По своей морфологии структуры, наблюдаемые в пиках P7 (A), P8 (B) и P9 (C), были классифицированы как трубчатые структуры (TS), цистерны (Cs) и везикулы с низкой, средней и высокой электродностью (LDV). , MDV и HDV соответственно). Репрезентативные изображения были показаны для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.g005

Разделение ядерных и митохондриальных компонентов в градиентах 30–60% сахарозы.

Помимо получения фракций, обогащенных органеллами классического пути секреции, ядерные и митохондриальные преципитаты также были разделены и охарактеризованы, чтобы обеспечить полный протокол фракционирования. Подобно микросомальному разделению, три видимые и хорошо разрешенные полосы, совпадающие с пиками белков и резким увеличением концентрации сахарозы, были получены в обоих градиентах (S6A и S6B, фиг.) С более высоким количеством белков в ядерном градиенте (S3-таблица). .В качестве отличительной особенности SDS-PAGE (S6D фиг.) Сильные полосы белка между 10 и 15 кДа присутствовали только в пике наивысшей плотности ядерного градиента (P3), который соответствовал гистонам (фиг. 4 и S7 фиг., P≤ 0,05).

Grp78 присутствовал в P1, P3 и P6 (фиг. 4 и S7, фиг.), Что совпадает с большей частью активности каталазы в P3 и P6 (S8 фиг.). Hsp60 располагался на пике максимальной плотности ядерного (P3) и митохондриального (P6) градиентов (p≤0,05). Флотилин 1 и голгин A5 показали ту же картину миграции, что и в 10-60% микросомальных градиентах, в то время как загрязнение Gapdh наблюдалось в основном в области более низкой плотности ядерного градиента (P1).Этот образец обогащения в ядрах, митохондриях, цис, -Гольджи и малых везикулярных органеллах, обнаруженный с помощью WB, также был подтвержден с помощью TEM (S9 фиг. ).

Генная онтологическая классификация микросомального протеома из 10–60% градиента сахарозы

Белковый состав микросомальных полос, собранных из 10–60% градиентов сахарозы, был выяснен с помощью протеомики дробовика (файл S1) и классифицирован по категориям генной онтологии с помощью алгоритмов DAVID и PANTHER. Всего было идентифицировано 2913, 2737 и 1983 белков для пиков P7-P9, соответственно (S10 фиг.).Три полосы имеют общие термины, связанные с транспортом белка, стыковкой и слиянием везикул, а также сворачиванием белка в биологических процессах (рис. 6A – 6C), молекулярными функциями (рис. 6D – 6F), функциональной классификацией (рис. S11A – S11C) и тестом избыточного представления. (S12 фиг.), Подтверждающие их принадлежность к органеллам классического пути секреции. P7 (фиг. 6A) и P8 (фиг. 6B) были обогащены терминами транспорта Гольджи, в то время как маннозидазная активность (α-маннозидазы класса II), характерная для цис--Гольджи, была специфичной для P8 (фиг. 6E).Катаболизм и стресс белка (фиг. S11C), сворачивание белка, нацеливание и локализация белка в ER и организация ER (фиг. S12C) были некоторыми из специфических для ER терминов, обнаруживаемых только в P9. Переход от аппарата Гольджи (P7, P8) к ER (P9) наблюдался в клеточных компонентах (S11D-S11F и S12D-S12F Figs), биологических процессах (S12A-S12C Figs) и молекулярных функциях (S12G-S12I Figs).

Рис. 6. Классификация микросомальных белков по DAVID.

Классификация белков по пикам P7 (A, D), P8 (B, E) и P9 (C, F) проводилась на основе биологического процесса (A-C) и молекулярной функции (D-F) с использованием кластеризации функциональных аннотаций DAVID.Трансп .: транспорт.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.g006

Обсуждение

Субклеточное фракционирование широко используется для биохимических, физиологических и клеточно-биологических исследований тканей и культивируемых клеток [3–5,8,11,13,52–55]. Поскольку клетки СНО являются «рабочей лошадкой» для производства белка в организме млекопитающих-хозяевах, и более глубокое знание их биологии может быть получено путем фракционирования, в этом исследовании были разработаны и охарактеризованы протоколы восстановления большинства их органелл, основанные на дифференциальном и последующем изопикническом центрифугировании. Внутри всех органелл те, которые принадлежат классическому пути секреции, играют преобладающую роль во время продукции рекомбинантных белков, во многих случаях представляя собой узкое место для увеличения продуктивности [31–33]. Таким образом, больший упор был сделан на анализ микросом, в результате чего был разработан новый градиент сахарозы, полностью совместимый с протеомикой, что позволит точно идентифицировать элементы, участвующие в повышении продуктивности.

Ядерные, митохондриальные и микросомальные гранулы, а также цитозоль были получены из гомогенатов после дифференциального центрифугирования, при котором полосы гистонов около 15 кДа в SDS-PAGE (S2 Рис.) Указывали на преимущественное обогащение ядра ядерным осадком, a факт впоследствии подтвержден WB (рис. 1) и ПЭМ (рис. 2).Микросомальный осадок был обогащен транс -Гольджи (golgin-97), тогда как цис--Гольджи, отслеживаемый golgin A5, был разделен на митохондриальные и микросомальные гранулы, как сообщалось [56]. Cs состоят из более плотных структур в митохондриальном осадке, которые осаждаются перед одиночными канальцами, выставленными микросомальным осадком, что может объяснять выделение golgin A5. Широкое распространение PM (флотилин 1) может быть связано с его очень низкой плотностью [7,14,19,22,56,57] и физическими связями с ER [7,58], что привело к его признанию в качестве распространенного загрязнителя в протоколы центрифугирования [59].ER (Grp78) также широко распределялся среди всех субклеточных компартментов, будучи более концентрированным в микросомальном осадке, в соответствии с его распределением в других клетках млекопитающих [7]. Такое широкое присутствие ER может быть объяснено физической близостью и во многих случаях контактами с другими органеллами [3,58–60], за исключением цитозоля, где его обнаружение указывает на некоторый разрыв органелл путем механической гомогенизации [24]. Расположение митохондрий (Hsp60) в ядерных и митохондриальных преципитатах, вероятно, было связано с перекрывающимися скоростями центрифугирования [19,36,59,61–63], различными популяциями митохондрий [35,36,56], разрывом ядер и агрегацией цитоскелета [19, 24,56,63,64].

Хотя его достаточно для ядерных и митохондриальных препаратов [2,63,65,66], дифференциальное центрифугирование не подходит для получения отдельных фракций других органелл, таких как ER, аппарат Гольджи и эндосомы [4,8,13,15, 36]. Таким образом, поскольку ядерные (неразрушенные клетки, ядра, митохондрии, ER, PM), митохондрии (митохондрии, ER, PM, цис, -Гольджи) и микросомальные гранулы (PM, транс -Гольджи, цис -Гольджи, ER ) были обогащены этими специфическими органеллами, тогда более высокая чистота была достигнута в градиентах сахарозы, где ядерные, мембранные и цитозольные белки были обнаружены как обычные загрязнители [14,19,22,23,67].

Учитывая важность микросом в экспрессии белка, два разных градиента сахарозы были оценены для успешного разделения этого осадка. В микросомальном градиенте 15–60% три видимые полосы были идентифицированы как транс, -Гольджи, цис, -Гольджи и ER в порядке возрастания плотности, как это было подтверждено для других биологических образцов [13,14,19,23 , 68]. Однако, как следствие частичного перекрытия в этом градиенте 15-60%, был разработан более резкий градиент 10-60% для увеличения разделения и выхода микросом.Соответственно, были получены три полосы (S6C на фиг.) С улучшенным разделением и фокусировкой (S4A и S4B на фиг.). Положения транс -Гольджи и ER оставались такими же, как и в градиенте 15-60%, в то время как цис -Гольджи был разделен между двумя наиболее плотными полосами (Рис. 4), вероятно, вызванный миграцией некоторых доменов этого органеллы к более плотному интерфейсу и совместной локализации с ER.

В 30–60% митохондриальном градиенте полоса наивысшей плотности образована в основном пероксисомами, цис--Гольджи, ER и митохондриями, тогда как из исследованных маркеров полоса средней плотности содержала только цис--Гольджи.Распределение цис -Гольджи и митохондрий во фракциях разной плотности в 30–60% градиентах можно объяснить гетерогенными популяциями этих органелл [69–74] и их тесным контактом друг с другом [75]. В ядерном градиенте WB и TEM указали на присутствие гладкого ER в полосе самой низкой плотности, в то время как полоса самой высокой плотности была существенно обогащена ядерными телами. Окончательный состав отделений от изопикнического центрифугирования представлен на S13 Рис.

Учитывая, что в предыдущих протоколах обычно отсутствуют биологические копии [1,13,23,66], измерения содержания белка [1,2,13,15,22,23,61,66] и значения стандартного отклонения [14], есть два преимущества описанными здесь процедурами фракционирования являются количественное распределение белковых маркеров [76] и количественное определение клеточных белков в каждой выделенной фракции. Что еще более важно, новый градиент сахарозы 10–60% облегчает выделение фракций, обогащенных органеллами, из классического пути секреции с большим разделением, эффективностью и разрешением, чем предыдущий градиент 15–60%.Кроме того, его можно легко включить в общие протоколы фракционирования клеток во время разделения микросом млекопитающих для изучения их состава, структуры и функций.

Чтобы расширить использование нового градиента 10–60% и охарактеризовать белковый состав микросомальных органелл, к фракциям, выделенным из этого градиента, была применена протеомика дробовика. В результате классификация протеомов показала, что все фракции сохранили свои ожидаемые функции в транспорте везикул, фолдинге и PTM белков.Фракции P7 и P8 соответствовали аппарату Гольджи согласно категориям онтологии генов, а полоса P8 принадлежала специфически цис / медиальному -Гольджи из-за его активности маннозидазы II [77–79]. P9 представляет ER, потому что многие из идентифицированных биологических процессов, компонентов и молекулярных функций происходят только в этой органелле [80–83]. Таким образом, помимо успешного получения обогащенных фракций компонентов Гольджи и ER для биохимических и молекулярных исследований, новый градиент сахарозы 10-60% оказался подходящим для протеомной характеристики этих органелл.

Выводы

Субклеточное фракционирование широко используется для морфологических, молекулярных, клеточных и омических исследований тканей и культивируемых клеток. Поскольку клетки СНО являются предпочтительным хозяином для экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, протоколы дифференциального и изопикнического центрифугирования были охарактеризованы и разработаны для этой линии клеток. Учитывая важную роль органелл классического пути секреции в экспрессии белков, фракционирование было сосредоточено в основном на разделении и обогащении микросомальных компонентов.Неочищенные препараты ядер, митохондрий, пероксисом, микросом и цитозоля могут быть получены путем дифференциального центрифугирования с последующим обогащением градиентами сахарозы. Ядра, цис, -Гольджи, гладкий ER и митохондрии выделяли в виде отдельных полос в градиенте 30–60%, причем пероксисомы обогащались вместе с ядрами и митохондриями. Разделение органелл транс, -Гольджи, цис, -Гольджи и ER было улучшено в новом градиенте сахарозы 10–60% по сравнению с предыдущим градиентом 15–60%, что позволило получить более видимые и четкие полосы.Идентичность этих микросомальных органелл была подтверждена протеомикой, предполагая, что этот протокол является полезным инструментом для протеомной характеристики классического пути секреции и для дифференциальных протеомных исследований этих органелл между различными клеточными фенотипами и клеточными состояниями. Удобство использования, воспроизводимость и надежность этого нового градиента указывают на то, что его можно также распространить на фракционирование других клеток млекопитающих для обогащения и изучения органелл классического пути секреции.Молекулярные, биохимические и протеомные характеристики обогащенных органелл из клеток СНО, полученные с помощью описанных здесь протоколов, помогут понять их биологию и получить необходимые знания для улучшения продукции рекомбинантных белков.

Дополнительная информация

S1 Рис. Кинетика роста клеток CRL-12444.

Клетки культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл в среде CDM4CHO. Концентрацию жизнеспособных клеток (темные кружки) и жизнеспособность (пустые кружки) определяли методом исключения красителя трипанового синего в камере Нойбауэра.Стандартное отклонение рассчитывали из двух биологических повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s001

(EPS)

S2 Рис. SDS-PAGE образцов от дифференциального центрифугирования.

Белая звездочка указывает на обогащение ядерным осадком белками с молекулярной массой примерно 15 кДа. Черными стрелками обозначены белковые полосы с дифференциальным распределением между субклеточными компартментами. Дорожки: 1: белковая лестница, 2: гомогенат, 3–5: ядерные, митохондриальные и микросомальные преципитаты, соответственно, 6: цитозоль.Репрезентативное изображение двух биологических копий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s002

(PPTX)

S3 Рис. Вестерн-блоттинг образцов после дифференциального центрифугирования.

Ядерные (N), митохондриальные (MT) и микросомальные (MC) осадки, а также цитозоль (CT) были получены из гомогенатов (HM) путем дифференциального центрифугирования. Grp78 (A), Gapdh (A), гистон h4 (A), Hsp60 (B), флотилин 1 (C), голгин A5 (D) и golgin-97 (E) были выбраны в качестве маркеров эндоплазматического ретикулума, цитозоля, ядра. , митохондрии, плазматическая мембрана, цис, -Гольджи и транс, -Гольджи, соответственно. Маркеры, соответствующие предсказанной молекулярной массе, обозначены черной стрелкой, а его изоформы, если они есть, — звездочкой. Репрезентативные изображения двух биологических копий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s003

(PPTX)

S4 Рис. Количественное определение белка и SDS-PAGE микросом в градиентах 15–60%.

Концентрация белка (темные кружки) и процентное содержание сахарозы (пустые кружки) были измерены во фракциях, собранных и пронумерованных сверху вниз пробирки (ось x, B).Картина полос была обнаружена с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих условиях (C, D). P1-P3: пики концентрации белка (A), PL: белковая лестница.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s004

(PPTX)

S5 Рис. Вестерн-блот микросомальных фракций в градиенте 15–60% сахарозы.

Обогащение Grp78 (A), Gapdh (A), гистона h4 (A), флотилина 1 (B, C), голгина A5 (D, E) и голгина-97 (F, G) было подтверждено Вестерн-блоттингом в фракции, собранные и пронумерованные сверху донизу трубки (2–17), соответствующие S4B Рис. Маркеры, соответствующие предсказанной молекулярной массе, обозначены черной стрелкой, а его изоформы, если они есть, — звездочкой. Репрезентативные изображения двух биологических копий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s005

(PPTX)

S6 Рис. Количественное определение белка и SDS-PAGE в градиентах 30–60% и 10–60% сахарозы.

Ядерные (A) и митохондриальные (B) гранулы были разделены в градиенте 30–60%, а осадок микросом (C) — в градиенте 10–60%.Концентрацию белка (темные кружки) и процентное содержание сахарозы (пустые кружки) измеряли в пиках протеина (P1-P9), собирали и пронумеровали сверху донизу пробирки (ось x). Картина полос была обнаружена с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих условиях (D). Белыми звездочками отмечены интенсивные полосы белков от 10 до 15 кДа. PL: Белковая лестница.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s006

(PPTX)

S7 Рис. Вестерн-блоттинг градиентов 30–60% и 10–60% сахарозы.

Обогащение Grp78 (A), Gapdh (A), гистона h4 (A), Hsp60 (B), флотилина 1 (C), голгина A5 (D) и голгина-97 (E) подтверждено вестерн-блоттингом на белок пики ядерных (P1-P3), митохондриальных (P4-P6) и микросомальных (P7-P9) градиентов, собранные и пронумерованные сверху донизу пробирки. Маркеры, соответствующие прогнозируемой молекулярной массе, обозначены черной стрелкой, а предполагаемые изоформы, если они присутствуют, — звездочкой. Репрезентативные изображения двух биологических копий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s007

(PPTX)

S8 Рис. Активность каталазы в градиентах 30–60% и 10–60% сахарозы.

Удельную активность измеряли как отношение между высотой пены (мм) и общим количеством белков (мг) в пиках белка, собранных в ядерном (P1-P3) и митохондриальном (P4-P6) градиентах. В микросомальных градиентах (P7-P9) специфической активности не обнаружено. Стандартное отклонение получено в двух биологических повторностях.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0237930.s008

(EPS)

S9 Рис. Электронно-микроскопическое исследование градиентов 30–60% сахарозы.

В соответствии с их морфологией структуры, наблюдаемые в ядерном (AC) и митохондриальном (DF) градиентах, были классифицированы как ядро ​​(N), митохондрии (MT), тубулярная структура (TS), цистерны (Cs), эндоплазматический ретикулум (ER) и везикулы низкой, средней и высокой плотности (LDV, MDV и HDV соответственно). Пики P1-P6 соответствовали изображениям A-F соответственно.Репрезентативные изображения были показаны для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s009

(PPTX)

S10 Рис. Микросомный протеом из пиков белка P7-P9 в градиентах 10–60% сахарозы.

Пики собирали, осаждали ацетоном и идентифицировали компоненты с помощью ЖХ-МС / МС против эталонного протеома яичника китайского хомячка. Диаграммы Венна были составлены из идентифицированных белков веб-инструментом VENNY v2.1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s010

(TIFF)

S11 Рис. Классификация микросомальных белков по DAVID.

Классификация белков из P7 (A, D), P8 (B, E) и P9 (C, F) была проведена на основе биологического процесса (A-C) и клеточного компонента (D-F) функциональной аннотационной таблицы DAVID. Трансп .: транспорт, FDR: частота ложных обнаружений.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s011

(TIF)

S12 Рис.

Классификация и картирование микросомальных белков с помощью PANTHER.

Белки из P7 (A, D, G), P8 (B, E, H) и P9 (C, F, I) были классифицированы в соответствии с терминами генной онтологии (биологический процесс [AC], клеточный компонент [DF], и молекулярная функция [GI]) с помощью теста избыточного представления PANTHER. Трансп .: транспорт, сборка: монтаж, акт: деятельность.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s012

(EPS)

S13 Рис. Состав органоидов фракций от изопикнического центрифугирования.

Обобщено обогащение субклеточных компартментов видимыми полосами / пиками белков от градиентов сахарозы.Определение производилось на основе SDS-PAGE, вестерн-блоттинга, ELISA, анализа каталазы и просвечивающей электронной микроскопии.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s013

(PPTX)

S2 Стол. Количественное определение белка в образцах после дифференциального центрифугирования.

Количество белка на миллион клеток и его процентное содержание были рассчитаны для ядерных, митохондриальных и микросомальных осадков, а также цитозоля с помощью дифференциального центрифугирования. Образцы солюбилизировали в буфере для изоэлектрической фокусировки и количественно определяли с помощью анализа Брэдфорда.Стандартное отклонение получено из двух биологических повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s015

(DOCX)

S3 Таблица. Количественное определение белка по пикам градиентов сахарозы 30–60% и 10–60%.

Количество белка на миллион клеток и его процентное содержание были рассчитаны для 9 пиков белка, собранных при изопикническом центрифугировании в градиентах сахарозы (P1-P3: ядерный, P4-P6: митохондриальный, P7-P9: микросомальный). Количество белка определяли количественно методом Брэдфорда.Стандартное отклонение получено из двух биологических повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s016

(DOCX)

S1 Файл. Протеомная характеристика микросомальных фракций.

Идентификация и количественная оценка микросомальных белков из фракций P7 (образцы 13–14), P8 (образцы 15–16) и P9 (образцы 17–18) в градиентах 10–60% сахарозы методом дробовиковой протеомики, из двух биологических повторений . Группы белков идентифицировали на основе эталонного протеома UP000001075.Данные были удалены из загрязнителей и групп, идентифицированных в обратной базе данных или с помощью PTM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s017

(XLSX)

S1 Необработанные изображения. Необработанные изображения иммуноблота детектировали с помощью набора хемилюминесцентных субстратов SuperSignal West Pico от Thermo Fisher Scientific (34579), а изображения получали с помощью сканера вестерн-блоттинга LI-COR C-DiGit Chemiluminescence (LI-COR Biosciences, NE, США). Гели

окрашивали кумасси бриллиантовым синим G 250 от Sigma-Aldrich (B8647), а изображения получали в тепловизоре Gel DocTM EZ с использованием программного обеспечения Image Lab, v6.0,1 (Bio-Rad, Калифорния, США).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237930.s018

(PDF)

Благодарности

Саумель Перес-Родригес — докторант Программы докторантуры в области биомедицины, Национальный автономный университет Мексики (UNAM). Мы благодарим доктора Марсела Лизано Соберон и доктора Алехандро Алагона Кано за их советы и критический обзор методологии и результатов экспериментов. Мы также благодарим Марту Суарес Суньигу за щедрый подарок антител против Hsp-60, голгина A5 и флотилина-1, а также Dr.Susana Castro за любезный подарок антител против митохондриальных мишеней. ТЕА-исследования стали возможны благодаря опыту и сотрудничеству доктора Родольфо Паредеса Диаса и доктора Альфредо Торреса Лариоса. Мы благодарим Eng. Абель Бланкас-Кабрера и Сандра Лус Эрнандес Охеда за их техническую помощь, а также магистру наук. Марио Трехо, из «Secretaría Técnica de Gestión y Transferencia de Tecnología», Instituto de Biotecnología, Национальный автономный университет Мексики, Куэрнавака, Морелос, Мексика, за техническую помощь в управлении.Мы хотим выразить нашу благодарность компании Sartorius De México, S.A. De C.V. за предоставленную техническую поддержку.

Ссылки

  1. 1.
    Baudhuin P, Berthet J. Электронно-микроскопическое исследование субклеточных фракций. II. Количественный анализ митохондриальной популяции, выделенной из печени крысы. J Cell Biol. 1967. 35: 631–648. pmid: 4294244
  2. 2.
    Батлер WH, Джуда JD. Подготовка изолированных митохондрий печени крысы к электронной микроскопии. J Cell Biol.1970; 44: 278–289. Доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/41 pmid: 41
  3. 3.
    Вэнс Дж. Э. Синтез фосфолипидов в мембранной фракции, связанной с митохондриями. J Biol Chem. 1990; 265: 7248–7256. pmid: 2332429
  4. 4.
    Spatuzza C, Renna M, Faraonio R, Cardinali G, Martire G, Bonatti S и др. Тепловой шок вызывает преимущественную трансляцию ERGIC-53 и влияет на путь его рециклинга. J Biol Chem. 2004. 279: 42535–42544. pmid: 15292203
  5. 5.Йейтс-младший, Гилкрист А., Хауэлл К.Э., Бержерон Дж.Дж. Протеомика органелл и крупных клеточных структур. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. 6: 702–714. pmid: 16231421
  6. 6.
    Peng F, Zhan X, Li M-Y, Fang F, Li G, Li C и др. Протеомный и биоинформатический анализ микросом печени мыши. Int J Proteomics. 2012; 2012: 832569. pmid: 22500222
  7. 7.
    Андреев А.Ю., Шен З., Гуан З., Райан А., Фахи Э., Субраманиам С. и др. Применение ансамблей протеомных маркеров для идентификации субклеточных органелл.Протеомика клеток Mol. 2010; 9: 388–402. pmid: 19884172
  8. 8.
    Амодио Г., Ренна М., Паладино С., Вентури С., Таккетти С., Молтедо О. и др. Стресс эндоплазматического ретикулума снижает экспорт из ER и изменяет архитектуру пост-ER компартментов. Int J Biochem Cell Biol. 2009. 41: 2511–2521. pmid: 19695339
  9. 9.
    Балч В.Е., Данфи В.Г., Браелл В.А., Ротман Дж. Э. Восстановление переноса белка между последовательными компартментами гольджи, измеренное по сопряженному включению N-ацетилглюкозамина.Клетка. 1984; 39: 405–416. pmid: 6498939
  10. 10.
    Домингес М., Фазель А., Дахан С., Ловелл Дж. , Хермо Л., Клод А. и др. Фузогенные домены мембран Гольджи изолируются в специализированные области стопки, которые могут высвобождаться путем механической фрагментации. J Cell Biol. 1999; 145: 673–688. pmid: 10330398
  11. 11.
    Lavoie C, Lanoix J, Kan FW, Paiement J. Бесклеточная сборка грубого и гладкого эндоплазматического ретикулума. J Cell Sci. 1996; 109: 1415–1425. pmid: 8799829
  12. 12.Сунь Ф-К, Вэй С., Ли Ч-З, Чанг И-С, Чао Ц-С, Лай И-К. Локализация GRP78 в митохондриях в условиях развернутого белкового ответа. Биохим Дж. 2006; 396: 31–39. pmid: 16433633
  13. 13.
    Erra MC, Iodice L, Lotti L.V, Bonatti S. Анализ клеточного фракционирования транспорта гликопротеина CD8 человека между эндоплазматическим ретикулумом, промежуточным компартментом и комплексом Гольджи в клетках, культивируемых тканью. Cell Biol Int. 1999; 23: 571–577. pmid: 10704241
  14. 14.
    Foster LJ, de Hoog CL, Zhang Y, Zhang Y, Xie X, Mootha VK и др.Карта органелл млекопитающих по профилированию корреляции белков. Клетка. 2006; 125: 187–199. pmid: 16615899
  15. 15.
    Gilchrist A, Au CE, Hiding J, Bell AW, Fernandez-Rodriguez J, Lesimple S и др. Количественный протеомный анализ секреторного пути. Клетка. 2006; 127: 1265–1281. pmid: 17174899
  16. 16.
    Чандрамули К., Цянь Пи. Протеомика: проблемы, методы и возможности преодоления сложности биологических образцов. Hum Genomics Proteomics. 2009; 2009: 239204.pmid: 20948568
  17. 17.
    Дрисси Р., Дюбуа М.Л., Бойсверт FM. Методы протеомики для анализа субклеточного протеома. FEBS J. 2013; 280: 5626–5634. pmid: 24034475
  18. 18.
    Ли ЙХ, Тан Х.Т., Чанг МСМ. Методы и стратегии субклеточного фракционирования для протеомики. Протеомика. 2010; 10: 3935–3956. pmid: 21080488
  19. 19.
    Паскуали С., Фиалка И., Хубер Л.А. Субклеточное фракционирование, электромиграционный анализ и картирование органелл. J Chromatogr B Biomed Sci Appl.1999; 722: 89–102. pmid: 10068135
  20. 20.
    Уолш Г. Тесты биофармацевтики 2018. Nat Biotechnol. 2018; 36: 1136. Доступно по ссылке: https://doi.org/10.1038/nbt.4305 pmid: 30520869
  21. 21.
    Balch WE, Rothman JE. Характеристика транспорта белка между последовательными компартментами аппарата Гольджи: асимметричные свойства донорной и акцепторной активности в бесклеточной системе. Arch Biochem Biophys. 1985; 240: 413–425. pmid: 29
  22. 22.
    Сезанн Л., Наварро Л., Токан Дж. Ф.Выделение плазматической мембраны и органелл из клеток яичника китайского хомячка. BBA — Biomembr. 1992; 1112: 205–214.
  23. 23.
    Моранд Дж. Н., Кент С. Одноэтапный метод субклеточного фракционирования общих гомогенатов клеток. Анальная биохимия. 1986; 159: 157–162. pmid: 3028210
  24. 24.
    Сторри Б., Амадден Э. Выделение субклеточных органелл. В: Deutscher MP, 1-е изд. Руководство по очистке белков. США: Academic Press; 1990. С. 203–225. https: // doi.org / https: //doi.org/10.1016/0076-6879 (90) 82018-W
  25. 25.
    Tsukamoto T, Yokota S, Fujiki Y. Выделение и характеристика мутантов клеток яичников китайского хомячка, дефектных в сборке пероксисом. J Cell Biol. 1990; 110: 651–660. pmid: 1689731
  26. 26.
    van Heusden GP, ​​Bos K, Raetz CR, Wirtz KW. Клетки яичников китайского хомячка, дефицитные по пероксисомам, лишены неспецифического белка-переносчика липидов (белка-носителя стерола 2). J Biol Chem. 1990; 265: 4105–4110. pmid: 2303496
  27. 27.Кристофору А., Малви С.М., Брекелс Л.М., Геладаки А., Харрелл Т., Хейворд П.С. и др. Черновая карта пространственного протеома плюрипотентных стволовых клеток мыши. Nat Commun. 2016; 7: 9992. pmid: 26754106
  28. 28.
    Ицхак Д.Н., Тянова С., Кокс Дж., Борнер Г.Х. Глобальное, количественное и динамическое картирование субклеточной локализации белков. Элиф. 2016; 5: e16950. pmid: 27278775
  29. 29.
    Mulvey CM, Breckels LM, Geladaki A, Britovšek NK, Nightingale DJH, Christoforou A и др.Использование hyperLOPIT для картирования пространственного протеома с высоким разрешением. Nat Protoc. 2017; 12: 1110–1135. pmid: 28471460
  30. 30.
    Жадот М., Бунен М., Тирион Дж., Ван Н., Син Дж., Чжао С. и др. Учет субклеточной локализации белка: компартмент-карта протеома печени крысы. Протеомика клеток Mol. 2017; 16: 194–212. pmid: 27923875
  31. 31.
    Ле Фурн В., Гирод П.А., Бусета М., Регами А., Мермод Н. Конструирование клеток СНО для предотвращения агрегации полипептидов и улучшения терапевтической секреции белка.Metab Eng. 2014; 21: 91–102. pmid: 23380542
  32. 32.
    Хасегава Х., Вендлинг Дж., Хе Ф., Трилиски Э., Стивенсон Р., Фрэйни Х и др. Кристаллизация человеческого IgG in vivo в эндоплазматическом ретикулуме сконструированных клеток яичника китайского хомячка (СНО). J Biol Chem. 2011; 286: 19917–19931. pmid: 21464137
  33. 33.
    Peng RW, Fussenegger M. Молекулярная инженерия движения экзоцитарных везикул увеличивает продуктивность клеток яичников китайского хомячка. Biotechnol Bioeng. 2009. 102: 1170–1181. pmid: 18989903
  34. 34.
    Гонсалес Т.Н., Леонг С.Р., Преста LG. Нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированные моноклональные антитела против IL-8. Соединенные Штаты; US6025158A, 2000. стр. 240. Доступно по адресу: https://patents.google.com/patent/US6025158A/en
  35. 35.
    Грэм Дж. М.. Выделение митохондрий из гомогената с использованием градиента плотности сахарозы. eLS. 2004; 1–7.
  36. 36.
    Грэм Дж. М.. Приготовление сырых субклеточных фракций методом дифференциального центрифугирования.ScientificWorldJournal. 2002; 2: 1638–1642. pmid: 12806153
  37. 37.
    Laemmli UK. Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага Т4. Природа. 1970; 227: 680–685. pmid: 5432063
  38. 38.
    Ивасе Т., Тадзима А., Сугимото С., Окуда К.И., Хиронака И., Камата Ю. и др. Простой анализ для измерения активности каталазы: визуальный подход. Sci Rep.2013; 3: 3081. pmid: 24170119
  39. 39.
    Luft JH. Улучшения в методах заливки эпоксидной смолой. J Cell Biol. 1961; 9: 409–414. pmid: 13764136
  40. 40.
    Кроуэлл AMJ, Wall MJ, Doucette AA. Максимальное извлечение водорастворимых белков за счет осаждения ацетоном. Анальный Чим Акта. 2013; 796: 48–54. pmid: 24016582
  41. 41.
    Кулак Н.А., Пихлер Г., Парон И., Нагарадж Н., Манн М. Минимальная инкапсулированная обработка протеомных образцов, применяемая для оценки числа копий в эукариотических клетках. Нат методы. 2014; 11: 319–324. pmid: 24487582
  42. 42.
    Раппсилбер Дж., Манн М., Исихама Ю.Протокол микроочистки, обогащения, предварительного фракционирования и хранения пептидов для протеомики с использованием StageTips. Nat Protoc. 2007; 2: 1896–1906. pmid: 17703201
  43. 43.
    Perez-Riverol Y, Csordas A, Bai J, Bernal-Llinares M, Hewapathirana S, Kundu DJ и др. База данных PRIDE и связанные с ней инструменты и ресурсы в 2019 году: улучшение поддержки количественных данных. Nucleic Acids Res. 2019; 47: D442 – D450. pmid: 30395289
  44. 44.
    Камачо К., Кулурис Дж., Авагян В., Ма Н., Пападопулос Дж., Билер К. и др.BLAST +: архитектура и приложения. BMC Bioinformatics. 2009; 10: 421. pmid: 20003500
  45. 45.
    Ми Х, Муругануджан А., Хуанг Х, Эберт Д., Миллс С., Гуо Х и др. Обновление протокола для крупномасштабного анализа генома и функций генов с использованием системы классификации PANTHER (v.14.0). Nat Protoc. 2019; 14: 703–721. pmid: 30804569
  46. 46.
    Ми Х, Муругануджан А, Касагранде Дж. Т., Томас П.Д. Масштабный анализ функций генов с использованием системы классификации пантер. Nat Protoc.2013; 8: 1551–1566. pmid: 23868073
  47. 47.
    Хуанг Д.В., Шерман Б.Т., Лемпицки Р.А. Систематический и комплексный анализ больших списков генов с использованием ресурсов биоинформатики DAVID. Nat Protoc. 2009. 4: 44–57. pmid: 19131956
  48. 48.
    Хуанг Д.В., Шерман Б.Т., Лемпицки Р.А. Инструменты обогащения биоинформатики: пути к всестороннему функциональному анализу больших списков генов. Nucleic Acids Res. 2009; 37: 1–13. pmid: 1

    63

  49. 49.
    Oliveros JC. Венни.Интерактивный инструмент для сравнения списков с диаграммами Венна. В: BioinfoGP CNB-CSIC [Интернет]. 2007 [цитировано 6 апреля 2019 года]. Доступно по адресу: http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
  50. 50.
    Команда RDC. R: Язык и среда для статистических вычислений. R Фонд статистических вычислений. Вена; 2016. https://doi.org/10.1007/978-3-540-74686-7
  51. 51.
    Полерт Т. Пакет для попарного множественного сравнения средних рангов (PMCMR). 2014. Доступно по адресу: https: // cran.r-project.org/package=PMCMR
  52. 52.
    Дрегер М. Анализ протеома на уровне субклеточных структур. Eur J Biochem. 2003; 270: 589–599. pmid: 12581199
  53. 53.
    Гримм С. Интерфейс ER-митохондрий: социальная сеть клеточной смерти. Biochim Biophys Acta — Mol Cell Res. 2012; 1823: 327–334. pmid: 22182703
  54. 54.
    Марчи С., Патергнани С. , Пинтон П. Связь эндоплазматического ретикулума и митохондрий: одно касание, множество функций. Biochim Biophys Acta — Bioenerg.2014; 1837: 461–469. pmid: 24211533
  55. 55.
    Ратури А., Симмен Т. Где эндоплазматический ретикулум и митохондрии связывают узел: ассоциированная с митохондриями мембрана (МАМ). Biochim Biophys Acta — Mol Cell Res. 2013; 1833: 213–224. pmid: 22575682
  56. 56.
    Грэм Дж. М.. Выделение мембран Гольджи из тканей и клеток методом дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности. Curr Protoc cell Biol. 2001; 10: 3.9.1–3.9.24.
  57. 57.
    Грэм Дж. М..Фракционирование Гольджи, эндоплазматического ретикулума и плазматической мембраны из культивируемых клеток в предварительно сформированном непрерывном градиенте йодиксанола. ScientificWorldJournal. 2002; 2: 1435–1439. pmid: 12805929
  58. 58.
    Английский AR, Voeltz GK. Структура эндоплазматического ретикулума и взаимосвязи с другими органеллами. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013; 5: a013227. pmid: 23545422
  59. 59.
    Хубер Л.А., Пфаллер К., Вьетор И. Протеомика органелл: значение для субклеточного фракционирования в протеомике.Circ Res. 2003. 92: 962–968. pmid: 12750306
  60. 60.
    Боле Д.Г., Доуин Р., Дорио М., Джеймисон Дж. Д. Иммуноцитохимическая локализация BiP в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме: доказательства сортировки белков путем избирательного удержания. J Histochem Cytochem. 1989; 37: 1817–1823. pmid: 2685110
  61. 61.
    Breuza L, Halbeisen R, Jenö P, Otte S, Barlowe C, Hong W. и др. Протеомика мембран промежуточного компартмента эндоплазматического ретикулума-Гольджи (ERGIC) из обработанных брефельдином А клеток HepG2 позволяет идентифицировать ERGIC-32, новый циклический белок, который взаимодействует с человеческим Erv46.J Biol Chem. 2004. 279: 47242–47253. pmid: 15308636
  62. 62.
    Michelsen U, von Hagen J. Выделение субклеточных органелл и структур. В: Burgess RR, Deutscher MP. Руководство по очистке белков. 2-е изд. Академическая пресса; 2009. С. 305–328. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(09)63019-6
  63. 63.
    Клейтон Д.А., Шадель Г.С. Выделение митохондрий из клеток и тканей. Cold Spring Harb Protoc. 2014; 2014: pdb.top074542. pmid: 25275115
  64. 64.
    Bahnemann J, Kayo S, Wahrheit J, Heinzle E, Pörtner R, Zeng AP.В поисках эффективного метода разрушения клеток для выделения интактных митохондрий из клеток яичника китайского хомячка. Eng Life Sci. 2014; 14: 161–169.
  65. 65.
    Димауро I, Пирсон Т., Капоросси Д., Джексон MJ. Простой протокол субклеточного фракционирования клеток и тканей скелетных мышц. BMC Res Notes. 2012; 5: 513. pmid: 22994964
  66. 66.
    Пауло Дж. А., Гаун А., Кадияла В., Гулиди А., Бэнкс П. А., Конвелл Д. Л. и др. Субклеточное фракционирование увеличивает протеомное покрытие клеток протока поджелудочной железы.Biochim Biophys Acta — протеомика белков. 2013; 1834: 791–797. pmid: 23352835
  67. 67.
    Ян М., Элленберг Дж., Бонифачино Дж. С., Вайсман А. М.. Трансмембранный домен закрепленного на карбоксильном конце белка определяет локализацию в эндоплазматическом ретикулуме. J Biol Chem. 1997; 272: 1970–1975. pmid: 8999888
  68. 68.
    Вонг Д.М., Адели К. Протеомика микросом. Методы Мол биол. 2009; 519: 273–289. pmid: 19381589
  69. 69.
    Миронов А.А., Павелка М. Аппарат Гольджи: состояние дел через 110 лет после открытия Камилло Гольджи.1-е изд. Springer-Verlag Wien; 2008. https://doi.org/10.1007/978-3-211-76310-0
  70. 70.
    Паттерсон Г. Х., Хиршберг К., Полищук Р. С., Герлих Д., Фейр Р. Д., Липпинкотт-Шварц Дж. Транспортировка через аппарат Гольджи путем быстрого разделения в двухфазной мембранной системе. Клетка. 2008. 133: 1055–1067. pmid: 18555781
  71. 71.
    Танимото К., Сузуки К., Джокитало Э, Сакаи Н., Сакагути Т., Тамура Д. и др. Характеристика YIPF3 и YIPF4, белков семейства доменов yip, локализующих цис-гольджи. Cell Struct Funct. 2011; 36: 171–185. pmid: 21757827
  72. 72.
    Ямаджи Т., Кумагаи К., Томишиге Н., Ханада К. Два белка-переносчика сфинголипидов, CERT и FAPP2: их роль в метаболизме сфинголипидов. IUBMB Life. 2008. 60: 511–518. pmid: 18459163
  73. 73.
    Хуанг Х.М., Фаулер С., Чжан Х., Гибсон Г.Э. Митохондриальная неоднородность внутри и между разными типами клеток. Neurochem Res. 2004. 29: 651–658. pmid: 15038612
  74. 74.
    Lopez-Mediavilla C, Orfao A, Gonzalez M, Medina JM.Идентификация с помощью проточной цитометрии двух отдельных популяций митохондрий, окрашенных родамином-123, в печени крыс. FEBS Lett. 1989. 254: 115–120. pmid: 2476332
  75. 75.
    Долман Н.Ю., Герасименко Ю.В., Герасименко О.В., Воронина С.Г., Петерсен О.Х., Тепикин А.В. Стабильные комплексы Гольджи-митохондрии и формирование градиентов Са2 + Гольджи в ацинарных клетках поджелудочной железы. J Biol Chem. 2005; 280: 15794–15799. pmid: 15722348
  76. 76.
    Plackett RL. Пределы отношения среднего диапазона к стандартному отклонению.Биометрика. 1947; 34: 120–122. pmid: 20287825
  77. 77.
    Rabouille C, Hui N, Hunte F, Kieckbusch R, Berger EG, Warren G, et al. Картирование распределения ферментов Гольджи, участвующих в построении сложных олигосахаридов. J Cell Sci. 1995; 108 (Pt 4): 1617–1627.
  78. 78.
    Веласко А., Хендрикс Л., Мормен К.В., Тулсиани Д.Р., Тустер О., Фаркуар М.Г. Зависящие от типа клетки вариации субклеточного распределения альфа-маннозидазы I и II. J Cell Biol. 1993; 122: 39–51.pmid: 8314846
  79. 79.
    Popp O, Moser S, Zielonka J, Rüger P, Hansen S, Plöttner O. Разработка предварительно гликоинженерной линии клеток-хозяев CHO-K1 для экспрессии антител с усиленной эффекторной функцией, опосредованной Fc. MAbs. 2018; 10: 290–303. pmid: 29173063
  80. 80.
    Ruggiano A, Foresti O, Carvalho P. Распад, связанный с ER: контроль качества белка и не только. J Cell Biol. 2014; 204: 869–879. pmid: 24637321
  81. 81.
    Берналес С., Сото М.М., Маккаллах Э.Развернутый белковый стресс в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях: роль в нейродегенерации. Front Aging Neurosci. 2012; 4: 5. pmid: 22539924
  82. 82.
    Зишан ХМА, Ли Г. Х., Ким Х. Р., Ча Х. Дж. Стресс эндоплазматического ретикулума и связанные с ним АФК. Int J Mol Sci. 2016; 17: 327. pmid: 26950115
  83. 83.
    Пфеффер С., Дудек Дж., Гогала М., Шорр С., Линксвайлер Дж., Ланг С. и др. Структура олигосахарилтрансферазного комплекса млекопитающих в транслоконе нативного белка ER.Nat Commun. 2014; 5: 3072. pmid: 24407213

мВт3328 511..522

% PDF-1.4
%
1 0 obj
>
эндобдж
5 0 obj
>
эндобдж
2 0 obj
>
транслировать
Acrobat Distiller 7.0 (Windows) 2011-03-09T22: 03: 19 + 05: 30Arbortext Advanced Print Publisher 9.1.510 / W2011-03-09T22: 03: 19 + 05: 30application / pdf

  • mwr3328 511..522
  • uuid: 3ca90c30-0863-4ffe-8003-8260eca79385uuid: 7fe08d6f-faa6-4016-9251-b9572f3fbc26

    конечный поток
    эндобдж
    3 0 obj
    >
    эндобдж
    4 0 obj
    >
    эндобдж
    6 0 obj
    >
    эндобдж
    7 0 объект
    >
    эндобдж
    8 0 объект
    >
    эндобдж
    9 0 объект
    >
    эндобдж
    10 0 obj
    >
    эндобдж
    11 0 объект
    >
    эндобдж
    12 0 объект
    >
    эндобдж
    13 0 объект
    >
    эндобдж
    14 0 объект
    >
    эндобдж
    15 0 объект
    >
    эндобдж
    16 0 объект
    >
    эндобдж
    17 0 объект
    >
    эндобдж
    18 0 объект
    >
    эндобдж
    19 0 объект
    >
    эндобдж
    20 0 объект
    >
    эндобдж
    21 0 объект
    >
    транслировать
    x +

    Запрошенный URL не может быть найден.

    | NTN Global

    Страница могла быть перемещена или удалена из-за обновления нашего сайта.
    Ознакомьтесь с темами по ссылкам ниже или воспользуйтесь поиском по сайту в правом верхнем углу.

    Продукция и технологии

    • Продукция по типу
    • Подшипники качения
      • Подшипник шариковый радиальный
      • Подшипник упорный шариковый
      • Подшипник роликовый радиальный
      • Подшипник упорный роликовый
      • Подшипники специального назначения
      • Подшипники линейного перемещения
    • Опорные блоки
    • Подшипниковый узел
    • Подшипники скольжения
    • Соединение с постоянной скоростью
    • Автоматические натяжители
    • Сцепления
    • Электродвигатель и привод
    • Датчик Сопутствующие товары
    • Питатели деталей
    • EV Система
    • Система мониторинга состояния (CMS)
    • Техническое обслуживание
    • NTN Green Power Station
    • NTN Micro Hydro Turbine
    • Послепродажное обслуживание
    • Изделия из композитных материалов
    • Продукты зеленой энергии
    • Новые продукты
    • Товаров по рынкам
    • Исследования и разработки
    • Технический обзор
    • Подшипники Supertechnology

    Каталог

    • Скачать каталог

    Инструменты поддержки

    • Данные CAD
    • Instruction Manual Download
    • Инструмент для технических расчетов подшипников
    • Инструмент поиска номера подшипника

    Практическое руководство: обращение и последующий уход

    • Обработка подшипников
    • Уход и обслуживание подшипников
    • Новости
    • О нас
    • Инвесторы
    • CSR
    • Карьера

    Влияние слабого линзирования на функцию трехточечной корреляции галактик (Журнальная статья)


    Шмидт, Фабиан, / Чикаго У. , Астрон. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго, Валлинотто, Альберто, / Париж, Inst. Astrophys., Sefusatti, Emiliano, / Fermilab, Dodelson, Scott, and / Chicago U., Astron. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго / Фермилаб. Влияние слабого линзирования на функцию трехточечной корреляции галактик . США: Н. П., 2008.
    Интернет. DOI: 10.1103 / PhysRevD.78.043513.


    Шмидт, Фабиан, / Чикаго У., Астрон. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго, Валлинотто, Альберто, / Париж, Inst. Astrophys., Sefusatti, Emiliano, / Fermilab, Dodelson, Scott, & / Chicago U., Astron. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго / Фермилаб. Влияние слабого линзирования на функцию трехточечной корреляции галактик . Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1103/PhysRevD.78.043513


    Шмидт, Фабиан, / Чикаго У., Астрон. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго, Валлинотто, Альберто, / Париж, Inst. Astrophys., Sefusatti, Emiliano, / Fermilab, Dodelson, Scott, and / Chicago U., Astron. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго / Фермилаб. Вт.
    «Слабые эффекты линзирования на функцию трехточечной корреляции галактик». Соединенные Штаты. https://doi.org/10.1103/PhysRevD.78.043513. https://www.osti.gov/servlets/purl/926773.

    @article {osti_926773,
    title = {Слабое влияние линз на функцию трехточечной корреляции Галактики},
    author = {Schmidt, Fabian and / Chicago U., Астрон. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго и Валлинотто, Альберто и / Париж, Inst. Astrophys. и Сефусатти, Эмилиано и / Фермилаб и Додельсон, Скотт и / Чикаго, Астрон. Astrophys. Ctr. / KICP, Чикаго / Фермилаб},
    abstractNote = {},
    doi = {10.1103 / PhysRevD.78.043513},
    url = {https://www.osti.gov/biblio/926773},
    journal = {},
    number =,
    volume =,
    place = {United States},
    год = {2008},
    месяц = ​​{4}
    }

    Упаковка из 2 штук 1PZ V02-M06 6 мм 1/4 из алюминиевого сплава с обратным контролем Односторонний клапан Сброс давления в топливной системе Дизель Бензин

    Упаковка из 2 1PZ V02-M06 6 мм 1/4 алюминиевый сплав с обратным контролем Давление в топливной системе с обратным клапаном Рельеф Дизель Бензин

    1PZ V02-M08 8 мм 5/16 ‘алюминиевый сплав с обратным контролем Односторонний клапан сброса давления топливной системы Дизель Бензин (упаковка из 2 шт. ): Автомобильная промышленность.Купить 1PZ V02-M08 8 мм 5/16 дюймов из алюминиевого сплава с невозвратной проверкой Односторонний клапан Сброс давления в топливной системе Дизель Бензин (комплект из 2 шт.): Вакуумные тройники — ✓ Возможна БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при определенных покупках. 【Очень прочный】 Срок службы алюминия головка для использования длиннее пластиковых головок.。 【Мелкие детали】 Стрелка, отмеченная на клапане, показывает направление потока жидкости, предотвращает возврат топлива в бак и удерживает его на линии. Таким образом, этот продукт может идеально решить проблему что ваш автомобиль запускается с трудом или медленно, потому что топливо течет обратно по магистралям.。 【Совместимость】 Также подходит для насосов водяного давления и камбузных насосов, которые не являются самовсасывающими。 【Невероятная надежность】 Стабильные характеристики, простая установка。 【Профессиональный класс】 обратный клапан — Идеально подходит для морских, автомобильных, караванов / жилых автофургонов и сельское хозяйство. 。 6 мм 1/4 «Функция: предотвращает отток топлива обратно в бак и удерживает его в линии. Применимость: подходит для карбюраторов и топливных систем низкого давления. Для использования с бензином, дизельным топливом, био / растительным маслом, парафиновым / керосиновым маслом , так далее.Материал: алюминий + резина NBR. Давление открытия : 0,2 бар Рабочее давление: 0,2-6 бар Рабочая температура: -30 ℃ -130 ℃。。

    Набор из 2 1PZ V02-M06 6 мм 1/4 Алюминиевый сплав Обратный обратный клапан Односторонний клапан Топливная система Сброс давления Дизель Бензин

    Не бойтесь; не отчаивайтесь, разработан с мыслью о путешественнике, наш широкий выбор элегантен для бесплатной доставки и бесплатного возврата, Quarter Master 110012 Pilot Bushing, сохраняет вашего ребенка уютным в любую погоду.Установка Просверлите отверстие в основном материале с помощью твердосплавного сверла подходящего диаметра, как указано в таблице. Подходящие для сезона: зима и осень, женские джинсы PacSun в двойную полоску Mom. Пожалуйста, дайте нам знать, если вы не удовлетворены. · Графическая печать высокой четкости, шаговый двигатель Nema 34 18–80 В переменного тока и цифровой шаговый драйвер, макс. 6 А, 24–110 В постоянного тока, 1203,94 унции в комплекте Шаговый ЧПУ STEPPERONLINE, 1 ось, 8,5 Нм. Имеет два кармана на молнии, куда можно положить деньги. Наш широкий выбор предлагает бесплатную доставку и бесплатный возврат, NCAA Fresno State Bulldogs Event Pack Clear.18 «x12»: товары для офиса, бесплатная подарочная коробка при каждой покупке. Модернизированная замена OEM для газового клапана печи White Rodgers B12826-14. Мы предлагаем носить эти носки мужчине-подростку. Приоритетная почтовая доставка с отслеживанием и страховкой на 50 долларов включена бесплатно при покупке, ONeal Mens Pants Black, 30. Вы получите 1 шт. Золото 22 карата, отполированное на 92. Некоторым людям нравится пачка короче, чем другим. Мужские ботинки Ork Tree, Модные зимние мотоциклетные ботинки на шнуровке. Мы предлагаем вам оставить нам свои мерки, чтобы лучше подогнать их. — То, что вы видите, это именно то, что вы получаете.Керамический стакан Black Kieragrace 4,5 на 3 дюйма, пожалуйста, дважды проверьте установку перед покупкой. Он запускается при температурах, превышающих 1, 4-канальный преобразователь декодера DMX-512 RGBSIGHT Контроллер постоянного напряжения DMX-PWM Декодер для 4-канального светодиодного светильника RGBW Многофункциональный полноцветный светодиодный контроллер декодера DMX 512 CV,: BESTCYC 1Box (5 комплектов) 5Colors Водонепроницаемые силиконовые гелевые затычки для ушей и зажим для носа для защиты ушей и носа пловца: спорт и активный отдых. Информация по уходу: можно мыть в посудомоечной машине.CCX18934 34 фута. Кабель управления Dometic SeaStar Xtreme. Описание продукта «Advancedaquatak 160» от Bosch — прочный и мощный инструмент для сложных задач очистки. Основные характеристики: Съемный и легкий. Подходит для большинства моделей прогулочных колясок UPF + Эргономичный дизайн обеспечивает максимальную боковую защиту от ветра и солнца.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *